RelB基因沉默DC對實(shí)驗(yàn)性重癥肌無力的治療作用及免疫調(diào)節(jié)機(jī)制研究.pdf

1、第一部分 小鼠RelB基因RNA干擾慢病毒載體的構(gòu)建及對樹突狀細(xì)胞成熟活化的影響 目的：構(gòu)建小鼠RelB基因RNA干擾慢病毒表達(dá)載體，探討其對小鼠骨髓源性樹突狀細(xì)胞RelB表達(dá)及成熟活化的影響 方法：根據(jù)Genebank RelB基因信息，設(shè)計(jì)了4個(gè)小干擾序列和1個(gè)陰性對照序列，利用慢病毒載體pGCSIL構(gòu)建了5個(gè)重組質(zhì)粒并進(jìn)行了慢病毒包裝，分別為LV-SiRelBl，LV-SiRelB2，LV-SiRelB3，

2、LV-SiRelB4，LV-SiNC：感染工具細(xì)胞NIH3T3細(xì)胞后，熒光定量PCR檢測干擾效率，選擇干擾效率最高的載體進(jìn)行慢病毒大量包裝。用篩選出的含有效靶點(diǎn)的慢病毒和陰性對照病毒感染小鼠骨髓樹突狀細(xì)胞（BMDC），并給予LPS刺激，相應(yīng)的DC命名為RelB-Silenced DC和Control DC；用熒光定量PCR和Western blot檢測干擾效率，流式細(xì)胞儀檢測表面分子CD86、CD80、MHCII，ELISA檢測培養(yǎng)上清

3、IL-6，IL-12，IL-23。 結(jié)果：測序結(jié)果證明5種質(zhì)粒載體的插入序列正確，鑒定證明慢病毒包裝成功。慢病毒感染NIH3T3細(xì)胞后，熒光定量PCR證實(shí)重組慢病毒LV-SiRelB3的干擾效率最高，對RelB mRNA表達(dá)的抑制達(dá)82％。熒光定量PCR和Western blot證實(shí)LV-SiRelB3感染BMDC可有效抑制DC中RelB mRNA和蛋白表達(dá)，抑制率分別達(dá)78.8％，75.2％。流式細(xì)胞儀和ELISA檢測證實(shí)，與

4、Control DC相比，RelB-Silenced DC CD86、CD80、MHCII表達(dá)及IL-6，IL-12，IL-23分泌水平顯著降低。 結(jié)論：成功構(gòu)建RelB RNAi重組慢病毒質(zhì)粒LV-SiRelB3，它能有效抑制小鼠骨髓源性樹突狀細(xì)胞RelB表達(dá)及成熟活化，為進(jìn)一步研究RelB基因沉默DC用于自身免疫性疾病治療奠定了基礎(chǔ)。 第二部分 RelB基因沉默DC對實(shí)驗(yàn)性重癥肌無力的治療作用及免疫調(diào)節(jié)機(jī)制

5、 目的：探討RelB基因沉默DC對實(shí)驗(yàn)性自身免疫性實(shí)驗(yàn)性重癥肌無力的治療作用及相關(guān)免疫調(diào)節(jié)機(jī)制。 方法：①RelB基因沉默DC或?qū)φ誅C與AChR反應(yīng)性CD4+T細(xì)胞共培養(yǎng)，并分別給予T-AChR、Tα146-162肽段、對照抗原OVA刺激，并設(shè)立無抗原刺激共培養(yǎng)體系為陰性對照。3H-TdR摻入法檢測CD4+T細(xì)胞增殖能力。②RelB基因沉默DC或?qū)φ誅C與AChR反應(yīng)性CD4+T細(xì)胞共培養(yǎng)，并分別給予T-AChR、Tα

6、146-162肽段刺激，收集培養(yǎng)上清用ELISA檢測IL-17，IFN-Y，IL-4，IL-10水平。③以第0，30，60天皮下注射（T-AChR+CFA）抗原乳劑免疫C57BL/6小鼠的方法誘導(dǎo)EAMG動(dòng)物模型。距初次免疫70天選取EAMG臨床評分達(dá)1-2分的C57BL/6小鼠隨機(jī)分為治療組和治療對照組，每組12只。治療組于入組后0，7，14天靜脈注射負(fù)載Tα146-162的RelB-Silenced DC，治療對照組于入組后0，7，

7、14天靜脈注射等量負(fù)載Tα146-162的Control DC。④入組后第20天，取靜脈血用ELISA方法檢測抗AChR IgG，IgG1，IgG2b，IgG2c滴度。⑤入組后第21天處死小鼠，取脾細(xì)胞用3H-TdR摻入法檢測淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)，ELISA檢測IL-17，IFN-Y，IL-4，IL-10水平，Western blot檢測Th17，Th1，Th2，Treg細(xì)胞相應(yīng)特異轉(zhuǎn)錄因子RORγ t，T-bet，GATA-3，F(xiàn)oxP3

8、表達(dá)水平。 結(jié)果：①在無抗原及對照抗原OVA存在時(shí)，AChR反應(yīng)性CD4+T細(xì)胞呈現(xiàn)低增殖反應(yīng)；在T-AChR及Tα146-162存在時(shí)，AChR反應(yīng)性CD4+T細(xì)胞呈現(xiàn)高增殖反應(yīng)；與對照DC共培養(yǎng)體系相比，RelB基因沉默DC共培養(yǎng)體系CD4+T細(xì)胞增殖反應(yīng)顯著降低。②與對照DC共培養(yǎng)體系相比，RelB基因沉默DC與AChR反應(yīng)性CD4+T共培養(yǎng)后，培養(yǎng)上清IL-17、IFN-γ水平顯著降低，而IL-4，IL-10水平顯著增高

9、。③與對照DC治療組相比，RelB基因沉默DC治療組小鼠平均臨床評分顯著降低，血清抗AChR IgG，IgG1，IgG2b滴度顯著減低。④與對照DC治療組相比，RelB基因沉默DC治療組脾淋巴細(xì)胞增值反應(yīng)顯著降低，Th17細(xì)胞標(biāo)志物（IL-17，RORγ t）和Thl細(xì)胞標(biāo)志物（IFN-γ，T-bet）顯著減低，Th2細(xì)胞標(biāo)志物（IL-4，GATA3）、Treg細(xì)胞標(biāo)志物（FoxP3）水平顯著增高。 結(jié)論：RelB基因沉默DC治