小劑量阿托伐他汀對(duì)實(shí)驗(yàn)性自身免疫性重癥肌無(wú)力免疫調(diào)節(jié)作用的研究.pdf

1、研究背景及目的：
　　 重癥肌無(wú)力(myasthenia gravis，MG)是由CD4+T細(xì)胞依賴與補(bǔ)體參與，抗煙堿型乙酰膽堿受體抗體介導(dǎo)，針對(duì)神經(jīng)肌肉接頭處突觸后膜上乙酰膽堿受體(acetylcholine receptor, AChR)進(jìn)行性破壞的一種自身免疫性疾病。實(shí)驗(yàn)性自身免疫性重癥肌無(wú)力(experimental autoimmune myasthenia gravis，EAMG)是模擬人類重癥肌無(wú)力發(fā)病的動(dòng)物模型。

2、其臨床表現(xiàn)、電生理學(xué)及免疫學(xué)與人類重癥肌無(wú)力頗為相似，是研究人類重癥肌無(wú)力的一種可靠動(dòng)物模型。
　　 他汀類藥物是公認(rèn)的降低血漿低密度脂蛋白和膽固醇水平的藥物，廣泛用于心腦血管疾病的治療。阿托伐他汀作為羥甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶抑制劑，其免疫調(diào)節(jié)功能主要是通過(guò)抑制甲羥戊酸(mevanolate，MVA)的生物合成，減少下游類異戊二烯焦磷酸法尼酯(farnesyl pyrophosphate，F(xiàn)PP)和焦磷酸牻牛兒基牻牛兒基酯(

3、geranylgeranyl pyrophosphate，GGPP)的生成，進(jìn)而抑制小GTP結(jié)合蛋白的活化和在細(xì)胞膜的錨定，阻斷Rho/Rock通路來(lái)實(shí)現(xiàn)的。
　　 他汀類藥物的免疫調(diào)節(jié)作用逐漸被人們所認(rèn)識(shí)，已被用于研究治療各種自身免疫性疾病動(dòng)物模型，包括:實(shí)驗(yàn)性自身免疫性神經(jīng)炎，實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎，實(shí)驗(yàn)性自身免疫性葡萄膜炎，實(shí)驗(yàn)性自身免疫性心肌炎等。尚未見(jiàn)他汀類藥物治療EAMG的研究報(bào)道。國(guó)際上有文獻(xiàn)報(bào)道:他汀類藥物可能

4、加重人類MG，但具體機(jī)制尚不清。本實(shí)驗(yàn)的目的在于探討小劑量阿托伐他汀對(duì)于EAMG的免疫調(diào)節(jié)作用。
　　 材料與實(shí)驗(yàn)方法：
　　 1.1.材料
　　 1.1.1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:雌性Lewis大鼠，6-8周齡，體質(zhì)量140-160g。
　　 1.1.2.主要試劑:抗原為人工合成鼠源乙酰膽堿受體α亞基97-116肽段。
　　 1.2.實(shí)驗(yàn)方法
　　 1.2.1.EAMG模型的誘導(dǎo)和臨床評(píng)分
　

5、　 于每只大鼠雙后足墊皮下給予200μL抗原乳液（含50μg R97-116肽，1 mgH37Ra結(jié)核桿菌，不完全弗氏佐劑）。并于免疫后第11 d進(jìn)行大鼠背部脊柱兩側(cè)皮下加強(qiáng)免疫1次。采用雙盲評(píng)估法，隔天評(píng)測(cè)大鼠肌力并記錄體質(zhì)量。肌力測(cè)量采用Lennon臨床評(píng)分。
　　 1.2.2.阿托伐他汀治療EAMG
　　 將10只Lewis大鼠隨機(jī)分成阿托伐他汀治療組（1 mg/kg）和對(duì)照組(溶劑DMSO)。于EAMG大鼠發(fā)病

6、初期開(kāi)始隔日給予阿托伐他汀腹腔注射治療，直至大鼠發(fā)病高峰期第49 d。
　　 1.2.3.免疫組化檢測(cè)大鼠胸腺中Foxp3的表達(dá)
　　 于發(fā)病高峰期處死大鼠，取大鼠胸腺，石蠟包埋切片，免疫組化方法檢測(cè)大鼠胸腺Foxp3的表達(dá)。
　　 1.2.4.淋巴結(jié)單個(gè)核細(xì)胞(mononuclear cells，MNC)懸液的制備
　　 無(wú)菌條件下，取腹股溝淋巴結(jié)，在盛有細(xì)胞濾器的培養(yǎng)皿中研磨淋巴結(jié)，制備淋巴結(jié)MNC懸

7、液。
　　 1.2.5.CCK-8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)
　　 取96孔板，每孔加入4×105個(gè)淋巴結(jié)MNC，并分為R97-116刺激組和對(duì)照組。細(xì)胞培養(yǎng)64 h后，吸取每孔細(xì)胞培養(yǎng)上清液，-20℃保存，擇日檢測(cè)細(xì)胞因子，然后每孔加入10μL CCK-8，4h后用酶標(biāo)儀測(cè)定其光密度值（OD值）。
　　 1.2.6.ELISA檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液細(xì)胞因子IL-4的表達(dá)
　　 用R97-116刺激淋巴結(jié)MNC培養(yǎng)64小時(shí)

8、后，吸取培養(yǎng)上清液。采用IL-4雙抗體夾心法ELISA試劑盒檢測(cè)培養(yǎng)上清液中細(xì)胞因子IL-4的表達(dá)水平。
　　 1.2.7.ELISA檢測(cè)大鼠血清抗R97-116抗體
　　 于發(fā)病高峰期處死大鼠，取心臟血，離心取血清，采用ELISA測(cè)血清中抗R97-116抗體的含量。
　　 1.3.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
　　 采用spss17.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，對(duì)兩組標(biāo)本進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，p＜0.05為差異

9、有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果：
　　 1.阿托伐他汀改善EAMG大鼠臨床癥狀
　　 2.阿托伐他汀上調(diào)EAMG大鼠胸腺Foxp3的表達(dá)
　　 3.阿托伐他汀對(duì)細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)的影響
　　 在PBS和R97-116刺激下的兩種情況下，阿托伐他汀治療組的MNC OD值均低于對(duì)照組，雖無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但趨勢(shì)是明顯的。
　　 4.阿托伐汀增加EAMG大鼠淋巴結(jié)單個(gè)核細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-4的水平