自身免疫性糖尿病T細(xì)胞及相關(guān)細(xì)胞因子的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：在自身免疫性糖尿病發(fā)病中，細(xì)胞免疫所起到的作用，主要包括CD4+和CD8+T細(xì)胞、NKT細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞等對(duì)胰島的浸潤，誘發(fā)胰島炎，在一定遺傳背景下多種細(xì)胞因子參與下T細(xì)胞對(duì)胰島的浸潤和破壞是自身免疫性糖尿病發(fā)病的中心環(huán)節(jié)，PTPN22基因1858位點(diǎn)C/T多態(tài)性與疾病中免疫功能異常有關(guān)。本研究將比較分析自身免疫性糖尿病調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg細(xì)胞)量和Treg細(xì)胞因子IL-10的表達(dá)水平，CD4+效應(yīng)性T細(xì)胞（Tef

2、f細(xì)胞）量和Teff細(xì)胞因子IL-2、IL-17、IFN-gamma的表達(dá)水平，檢測(cè)PTPN22基因第1858位C/T多態(tài)性，并分析這種多態(tài)性與自身免疫性糖尿病中重要的細(xì)胞因子IL-2、IL-10、IL-17和IFN-gamma表達(dá)量的關(guān)系。比較LADA、1型糖尿病和對(duì)照組2型糖尿病以及正常人之間的差異，為分型以及進(jìn)一步了解自身免疫性糖尿病發(fā)病機(jī)制奠定理論基礎(chǔ)。
　　 方法：研究對(duì)象為選自2009年1月至2012年1月北京協(xié)和醫(yī)

3、院內(nèi)分泌科門診就診的1型糖尿病患者19例、LADA患者14例、2型糖尿病患者（年齡≤45歲，病程≤5年，BMI≤30kg/m2）20例、正常人20例。收集受試者臨床資料和外周血樣本。采用流式細(xì)胞分析方法檢測(cè)Treg和CD4+Teff細(xì)胞，real time-qPCR方法檢測(cè)細(xì)胞因子IL-2、IL-10、IL-17和IFN-gamma表達(dá)，基因測(cè)序方法檢測(cè)PTPN22基因1858位點(diǎn)C/T多態(tài)性。
　　 結(jié)果：
　　 Tr

4、eg及Teff細(xì)胞占CD3+CD4+淋巴細(xì)胞百分比：
　　 CD3+CD4+CD25+CD127-T細(xì)胞表示Treg細(xì)胞數(shù)量，1型糖尿病、LADA、2型糖尿病和對(duì)照組Treg細(xì)胞占CD3+CD4+T細(xì)胞比例分別是6.39±1.82％、7.32±2.42％、6.62±1.69％、6.48±2.32％,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=0.64，P=0.592)。而CD3+CD4+T細(xì)胞中除Treg以外均為Teff細(xì)胞，1型糖尿病、LADA、2

5、型糖尿病和對(duì)照組Teff細(xì)胞占CD3+CD4+T細(xì)胞比例分別是93.61±1.82％、92.67±2.42％、93.37±1.69％、93.52±2.32％,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=0.641，P=0.591)。
　　 IL-2、IL-10、IL-17和IFN-gamma mRNA相對(duì)表達(dá)水平：
　　 LADA組IL-10相對(duì)表達(dá)量1.35±0.54，明顯高于T2DM組0.98±0.41和對(duì)照組1.0±0.34(P＜0.0

6、5)，與T1DM組1.15±0.3無顯著差異。
　　 IL-2相對(duì)表達(dá)量T1DM組1.2±0.46，LADA組0.98±0.4，T2DM組1.0±0.24，對(duì)照組1.0±0.32，四組間無顯著差異。
　　 IL-17相對(duì)表達(dá)量T1DM組1.07±0.48，LADA組1.03±0.4，T2DM組0.96±0.34，對(duì)照組1.0±0.34，四組間無顯著差異。
　　 IFN-gamma相對(duì)表達(dá)量T1DM組1.02±0.

7、28，LADA組1.13±0.51，T2DM組1.04±0.35，對(duì)照組1.0±0.34，四組間無顯著差異。
　　 對(duì)Treg細(xì)胞/CD3+CD4+T細(xì)胞比例與上述四種細(xì)胞因子表達(dá)進(jìn)行相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)T1DM組Treg細(xì)胞/CD3+CD4+細(xì)胞比例與IFN-gamma相對(duì)表達(dá)量成負(fù)相關(guān)，rs=-0.678，P=0.001; Treg細(xì)胞/CD3+CD4+細(xì)胞比例與IL-10表達(dá)量成正相關(guān)，rs=0.773, p＜0.001。

8、r>　　 PTPN22基因1858位點(diǎn)分型：
　　 1型糖尿病組PTPN22基因1858位點(diǎn)CC基因型為13人(68.4％)，CT基因型有4人(21％)，TT基因型有2人(10.6％)，C基因頻率為79％,T基因頻率為21％。LADA組CC基因型有9人(64.2％)，CT基因型有3人(21.4％)，TT基因型有2人(14.4％)，C基因頻率為75％,T基因頻率為25％。
　　 T2DM組CC基因型有15人(75％)，C

9、T基因型有4人(20％)，TT基因型有1人(5％)，C基因頻率為85％,T基因頻率為15％。
　　 對(duì)照組CC基因型有16人(80％)，CT基因型有4人(20％)，TT基因型有0人，C基因頻率為90％,T基因頻率為10％。
　　 四組間CC、CT、TT基因型頻率及C、T等位基因頻率均無差異。
　　 Spearman相關(guān)性檢驗(yàn)C＞T突變率與IL-2、IL-10、IL-17和IFN-gamma表達(dá)量無顯著線性相關(guān)。<

10、br>　　 結(jié)論：IL-10在LADA患者中表達(dá)量顯著高于T2DM和正常人，并且有高于T1DM的趨勢(shì)。提示LADA個(gè)體胰島beta細(xì)胞自身免疫破壞較T1DM緩慢。T1DM組Treg細(xì)胞與IL-10表達(dá)量成正相關(guān)，與IFN-gamma表達(dá)量成負(fù)相關(guān)，提示T1DM中保護(hù)性因素和破壞性因素平衡打破，以IL-10和IFN-gamma失衡為重要表現(xiàn)。本研究并未發(fā)現(xiàn)T1DM、LADA、T2DM和對(duì)照組之間1858位點(diǎn)C/T多態(tài)性的差異，以及這個(gè)位