人臍血源基質(zhì)細胞對骨髓瘤KM3細胞增殖和凋亡的影響及機制探討.pdf

1、多發(fā)性骨髓瘤(multiple myeloma，MM)是來源于終術(shù)分化的B淋巴細胞的惡性腫瘤，在造血系統(tǒng)腫瘤中占10％，占全部惡性腫瘤的1％，屬于中老年性疾病。多發(fā)性骨髓瘤以骨髓中漿細胞的克隆性增生，血清或尿液中出現(xiàn)單克隆免疫球蛋白或其成分(M蛋白)，正常免疫球蛋白受到抑制以及廣泛溶骨病變和/或骨質(zhì)疏松為特征。多發(fā)性骨髓瘤存在多步驟、多階段的復雜發(fā)病機制，近年主要集中在細胞遺傳學異常、骨髓微環(huán)境與骨髓瘤細胞相互作用、NF-kB及Notc

2、h信號通路和耐藥機制幾方面。 造血微環(huán)境(hematopoietic inductive microenvironment，HIM)是造血干/祖細胞在骨髓定居、增殖、分化、發(fā)育和成熟的場所，是支持和調(diào)節(jié)造血細胞生長發(fā)育的內(nèi)環(huán)境；另一方面，造血微環(huán)境也在血液病的發(fā)生、發(fā)展，血液腫瘤細胞增殖、凋亡等病理生理過程中發(fā)揮重要作用。研究證實，多發(fā)性骨髓瘤細胞的發(fā)病及瘤細胞的增殖、分化、凋亡與造血微環(huán)境尤為密切。而骨髓基質(zhì)細胞(bone m

3、arrow stromal cells，BMSCs)作為造血微環(huán)境的主要成份和功能單位，通過與腫瘤細胞的直接粘附和分泌多種細胞因子影響骨髓瘤細胞生長、生存、耐藥和遷移。 150年來，從馬法蘭的引入到大劑量化療聯(lián)合造血干細胞移植，雖使MM治療的有效率和完全緩解率有所提高，但復發(fā)率仍然很高，目前MM仍是一種不能治愈的疾病。近年隨著基因芯片和蛋白組學等生物技術(shù)的發(fā)展，學者們對MM提出更側(cè)重于微環(huán)境和細胞因子網(wǎng)絡(luò)的靶向治療。越來越多的研

4、究表明，通過改造骨髓瘤細胞賴以生存的病態(tài)骨髓造血微環(huán)境有利于瘤細胞的清除。 那么能否采用非骨髓來源的基質(zhì)細胞替代病態(tài)造血微環(huán)境以促進骨髓瘤細胞的清除呢？研究表明，從肝臟、肺臟、胸腺及皮膚等組織來源的基質(zhì)細胞尚不能達到理想的體外HIM模型的功能。我室在前期研究工作中在國內(nèi)外首先發(fā)現(xiàn)和證實了臍血中存在有基質(zhì)細胞的前體細胞，并經(jīng)體外培養(yǎng)擴增獲得人臍血源基質(zhì)細胞(human umbilicalcord blood-derived str

5、omal cells，hUCBDSCs)，證明其具備造血基質(zhì)細胞的基本特征和造血調(diào)控的物質(zhì)基礎(chǔ)，得到了國際同行認可。我們在前期研究工作中將人急性淋巴細胞白血病Jurkat細胞株分別與hUCBDSCs和正常人BMSCs共培養(yǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)hUCBDSCs-HIM具有較hBMSCs-HIM對Jurkat細胞更強的抑制增殖作用和促凋亡現(xiàn)象。相比白血病，多發(fā)性骨髓瘤的發(fā)生發(fā)展更依賴于病態(tài)的造血微環(huán)境，那么體外用hUCBDSCs-HIM代替患者的病態(tài)

6、BMSCs-HIM，對骨髓瘤細胞的增殖和凋亡是否會有類似的效應(yīng)呢？ 為了初步探討體外hUCBDSCs-HIM對多發(fā)性骨髓瘤細胞增殖和凋亡的作用，本課題在構(gòu)建骨髓瘤KM3細胞/hUCBDSCs共培養(yǎng)模型的基礎(chǔ)上，體外觀察hUCBDSCs對多發(fā)性骨髓瘤細胞抑制增殖和促凋亡的作用。從IL-6/IL-6R途徑、NF-1(B及其調(diào)控基因途徑兩個方面深入探討體外hUCBDSCs對骨髓瘤細胞抑制增殖和促凋亡的可能機制，為促進骨髓瘤細胞的清除，

7、提供新的輔助治療措施。 方法： 1.人臍血源基質(zhì)細胞對骨髓瘤KM3細胞抑制增殖和促凋亡的體外研究 實驗分組：①KM3細胞懸浮培養(yǎng)組；②KM3細胞/hUCBDSCs共培養(yǎng)組；③KM3細胞/MM-BMSCs共培養(yǎng)組。倒置顯微鏡和掃描電鏡觀察KM3細胞和基質(zhì)細胞的位相關(guān)系；CCK8法繪制KM3細胞生長曲線；流式細胞儀檢測KM3細胞的細胞周期和凋亡情況，透射電鏡觀察KM3細胞超微結(jié)構(gòu)。 2.IL-6/IL-6R途

8、徑在人臍血源基質(zhì)細胞抑制骨髓瘤KM3細胞增殖中的作用 ELISA法檢測共培養(yǎng)前后KM3細胞、hUCBDSCs和MM-BMSCs培養(yǎng)上清IL-6和sIL-6R濃度；激光共聚焦、流式細胞儀檢測不同培養(yǎng)條件下KM3細胞IL-6R蛋白表達，real time PCR檢測KM3細胞IL-6R mRNA表達水平。 3.NF-kB途徑在人臍血源基質(zhì)細胞對骨髓瘤KM3細胞抑制增殖和促凋亡中的作用 3.1人臍血源基質(zhì)細胞對骨髓瘤

9、KM3細胞NF-kB活化的抑制作用 EMSA法、激光共聚焦顯微鏡檢測不同培養(yǎng)條件下KM3細胞NF-1CB活化情況，Western blot法檢測KM3細胞IkBa表達水平。 3.2人臍血源基質(zhì)細胞對骨髓瘤KM3細胞NF-kB靶基因的抑制作用 流式細胞儀、激光共聚焦顯微鏡檢測不同培養(yǎng)條件下KM3細胞ICAM-1蛋白表達，real timePCR檢測KM3細胞ICAM-1 mRNA表達水平。 Wester

10、n blot、激光共聚焦顯微鏡檢測不同培養(yǎng)條件下KM3細胞Bcl-2、Bcl-XL蛋白表達，real timePCR檢測KM3細胞Bcl-2、Bcl-XL mRNA表達水平。 結(jié)果： 1.倒置顯微鏡觀察，KM3細胞呈球形，粘附在hUCBDSCs表面，隨培養(yǎng)時間的延長，KM3細胞數(shù)量逐漸增多；掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)KM3細胞可通過偽足粘附于hUCBDSCs表層，或龕于hUCBDSCs融合所形成的“網(wǎng)眼”中，部分hUCBDSCs胞

11、膜突起與多個KM3細胞粘附，形成“放射狀”排列。KM3細胞生長曲線顯示KM3/hUCBDSCs組KM3細胞增殖最慢；細胞周期結(jié)果顯示KM3/hUCBDSCs組S期細胞比例最高，G2/M期比例最低，顯示hUCBDSCs共培養(yǎng)組KM3細胞阻滯于S期。凋亡率結(jié)果顯示KM3/hUCBDSCs組KM3細胞凋亡率最高，死亡率無顯著差異。 2.IL-6/IL-6R途徑在人臍血源基質(zhì)細胞抑制骨髓瘤KM3細胞增殖的中的作用 ELISA檢

12、測結(jié)果顯示hUCBDSCs也分泌IL-6，并且共培養(yǎng)后KM3細胞可以刺激hUCBDSCs分泌IL-6；但無論是共培養(yǎng)前還是共培養(yǎng)后IL-6的表達水平均明顯低于MM-BMSCs分泌IL-6水平。ELISA法檢測共培養(yǎng)前后KM3細胞分泌sIL-6R的水平，顯示與hUCBDSCs共培養(yǎng)后KM3細胞分泌sIL-6R的水平下降地更明顯；流式細胞儀檢測也顯示與hUCBDSCs共培養(yǎng)后KM3細胞mIL-6R表達的陽性率下降得更明顯；real time

13、 PCR檢測不同培養(yǎng)條件下KM3細胞IL-6R mRNA表達情況，結(jié)果顯示與hUCBDSCs共培養(yǎng)后KM3細胞IL-6R mRNA表達最低。 3.NF-kB途徑在人臍血源基質(zhì)細胞對骨髓瘤KM3細胞抑制增殖和促凋亡中的作用 3.1 EMSA法和激光共聚焦顯微鏡檢測結(jié)果顯示與hUCBDSCs共培養(yǎng)后KM3細胞NF-kB的活性最低，NF-kB在部分KM3細胞胞漿高表達、胞核不表達或低表達；Westernblot檢測顯示hUCB

14、DSCs共培養(yǎng)組KM3細胞IkBa蛋白的表達明顯增強。 3.2流式細胞儀和激光共聚焦顯微鏡檢測顯示與hUCBDSCs共培養(yǎng)的KM3細胞ICAM-1蛋白表達平均熒光強度明顯減弱，MM-BMSCs共培養(yǎng)組KM3細胞ICAM-1表達明顯增強，且可在部分KM3細胞胞漿中發(fā)現(xiàn)紅色點狀熒光：real time PCR檢測不同培養(yǎng)條件下KM3細胞ICAM-1 mRNA表達情況，與hUCBDSCs共培養(yǎng)后KM3細胞ICAM-1 mRNA表達最低

15、。 Western blot和激光共聚焦顯檢鏡檢測顯示與hUCBDSCs共培養(yǎng)的KM3細胞Bcl-2、Bcl-XL表達明顯減弱，MM-BMSCs共培養(yǎng)組KM3細胞Bcl-2、Bcl-XL表達明顯增強；real time PCR檢測不同培養(yǎng)條件下KM3細胞Bcl-2、Bcl-XL mRNA表達情況，與hUCBDSCs共培養(yǎng)后KM3細胞Bcl-2、Bcl-XL mRNA表達最低。 結(jié)論： 1.人臍血源基質(zhì)細胞對骨髓

16、瘤KM3細胞有抑制增殖和誘導凋亡的作用：①生長曲線——細胞擴增速度受抑；②細胞周期--S期細胞比例明顯增多，但G2/M期細胞比例減少，細胞周期阻滯于S期；③掃描電鏡——可見KM3通過偽足粘附、龕合于hUCBDSCs細胞：④凋亡率：凋亡率增加；透射電鏡——可見凋亡和死亡細胞。 2.hUCBDSCs可以分泌IL-6并且骨髓瘤KM3細胞也可促進其分泌IL-6：hUCBDSCs構(gòu)成的新型造血微環(huán)境IL-6的表達水平顯著低于MM-BMSC