重組人PDCD5蛋白對(duì)地塞米松誘導(dǎo)的KM3多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞凋亡的影響及機(jī)制探討.pdf

1、背景與目的： 多發(fā)性骨髓瘤（Multiple Myeloma，MM）是一種漿細(xì)胞惡性克隆性增生性疾病，好發(fā)于中老年人，是發(fā)病率較高的血液系統(tǒng)惡性腫瘤。由于瘤細(xì)胞增殖時(shí)間長(zhǎng)以及瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的多藥耐藥，因此多發(fā)性骨髓瘤大部分患者對(duì)于傳統(tǒng)的治療反應(yīng)較差，復(fù)發(fā)率高。因而亟需了解新的、有效的治療靶標(biāo)。近年來(lái)隨著對(duì)MM生物學(xué)病因及發(fā)生機(jī)制研究的深入，認(rèn)為凋亡下調(diào)是其惡性細(xì)胞無(wú)序擴(kuò)增的主要原因。抑制細(xì)胞增殖及增加腫瘤細(xì)胞的凋亡成為該腫瘤治

2、療研究的重要方向。 細(xì)胞凋亡相關(guān)基因TFAR19（TF-1 cell apoptosis related gene-19），即程序化細(xì)胞死亡分子5（Programmed cell death5，PDCD5），是從人白血病細(xì)胞株TF-1細(xì)胞中克隆到的凋亡相關(guān)新基因之一。研究表明其廣泛表達(dá)于多種組織，并且在多種惡性腫瘤組織中表達(dá)下調(diào)。并有研究顯示，PDCD5經(jīng)過(guò)真核表達(dá)載體導(dǎo)入或大腸桿菌表達(dá)重組蛋白導(dǎo)入多種細(xì)胞后，單獨(dú)不能對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生

3、明顯的影響，但加入誘導(dǎo)凋亡的因素可明顯促進(jìn)細(xì)胞凋亡。 我們前期研究發(fā)現(xiàn)，在MM患者骨髓單個(gè)核細(xì)胞中存在PDCD5的表達(dá)較正常人明顯下調(diào)，但是PDCD5基因產(chǎn)物PDCD5蛋白是否對(duì)多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞有促凋亡作用尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)將人重組PDCD5蛋白單獨(dú)或/和凋亡誘導(dǎo)劑地塞米松聯(lián)用，觀測(cè)PDCD5表達(dá)蛋白對(duì)地塞米松誘導(dǎo)人KM3多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞凋亡的影響，并進(jìn)一步探討其作用機(jī)制。 方法： 將不同濃度10 mg/L、20

4、mg/L的rhPDCD5蛋白單獨(dú)或/和8mg/L地塞米松同時(shí)加入處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的KM3多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞株中共同培養(yǎng)16h后收集細(xì)胞： 1.通過(guò)普通倒置顯微鏡和DAPI染色后熒光顯微鏡觀察KM3細(xì)胞的形態(tài)變化。 2.Annexin V-FITC＆PI雙染法應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)（Flowcytometry，F(xiàn)CM）檢測(cè)KM3細(xì)胞凋亡率。 3.蛋白免疫印跡方法（Western-blotting，WB）檢測(cè)KM3細(xì)胞Caspa

5、se-3活性。 4.免疫細(xì)胞化學(xué)法（Immunocytochemical，ICC）檢測(cè)KM3細(xì)胞Survivin蛋白表達(dá)。 結(jié)果： 不同濃度的rhPDCD5蛋白分別與DXM聯(lián)用組作用16h后通過(guò)光學(xué)顯微鏡可觀察到多數(shù)細(xì)胞皺縮、胞膜發(fā)泡及不規(guī)則凹陷，核固縮、核分裂等凋亡相關(guān)形態(tài)學(xué)改變；單用組PDCD5蛋白或DXM組可觀察到部分細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)改變，但不如聯(lián)用組明顯；PBS對(duì)照組細(xì)胞形態(tài)無(wú)明顯變化。用FCM分析KM3細(xì)

6、胞凋亡率，兩者聯(lián)用組較單用組凋亡率明顯增加，且濃度較高PDCD5蛋白組作用更明顯。WB法檢測(cè)KM3細(xì)胞Caspase-3蛋白活性，顯示聯(lián)用組較單用組明顯上調(diào)，劑量較高PDCD5蛋白組（20mg/L）的Caspase-3的裂解激活較劑量較低PDCD5蛋白（10mg/L）組明顯。ICC檢測(cè)KM3細(xì)胞Survivin蛋白表達(dá)，顯示兩者聯(lián)用組較單用組表達(dá)明顯下調(diào)，并且濃度較高PDCD5蛋白組Survivin表達(dá)下調(diào)更明顯。 結(jié)論：