西地那非對(duì)血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞增殖和凋亡的影響及機(jī)制探討.pdf

1、研究背景
　　血管瘤(hemangiomas)是發(fā)生在嬰幼兒的血管源性良性腫瘤，發(fā)病率高達(dá)10～12％，絕大多數(shù)在出生時(shí)或出生后不久發(fā)現(xiàn)，大部分可自行消退，但仍有20％的血管瘤不能消退。根據(jù)病變發(fā)展過(guò)程可分為增殖期、消退期和消退完成期。血管瘤雖然屬于良性腫瘤，但發(fā)生在口腔頜面及頸部的病變，不僅嚴(yán)重影響面容美觀，還可能由于病變阻塞呼吸道、消化道而影響發(fā)音、進(jìn)食，甚至導(dǎo)致局部出血、窒息并危及生命。因此目前主張對(duì)該病應(yīng)積極進(jìn)行早期治療。

2、血管瘤常用的治療方法有藥物治療、激光、手術(shù)切除、冷凍以及硬化治療等。冷凍、激光及硬化治療易導(dǎo)致增生或萎縮性瘢痕、色素沉著或色素減退等，手術(shù)切除僅適用于局限性的血管瘤的治療。藥物治療則是一種治療早期血管瘤安全、有效的方法。治療血管瘤的藥物有多種，目前國(guó)內(nèi)外常用藥物包括以下幾類(lèi):1.β-腎上腺素受體阻滯劑，以普萘洛爾(propranolol)為主;2.皮質(zhì)類(lèi)固醇激素，以潑尼松(prednisolone)為主;3.其它:α-干擾素(IFN-α

3、)、咪喹莫特(Imiquimod)、抗腫瘤藥環(huán)磷酰胺(CTX)及長(zhǎng)春新堿(VCR)等。2008年，在《新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志》上，Leaute-LabrezeC等首次報(bào)道口服普萘洛爾引起了鼻咽部血管瘤的消退。近年來(lái)，口服普萘洛爾逐漸成為治療血管瘤的一線藥物。
　　2012年，Swetman等首次報(bào)道口服西地那非(sildenafil)治療3名淋巴管畸形患兒后病變顯著消退，發(fā)表于《新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志》上，提示西地那非可作為治療淋巴管畸形的一

4、種新型藥物。但該文章僅展示了患兒病變部位的照片和核磁共振平片(magnetic resonance imaging，MRI)，病變均未經(jīng)手術(shù)及病理證實(shí)為淋巴管畸形。根據(jù)MRI表現(xiàn)，我們認(rèn)為此患兒更符合血管瘤伴發(fā)淋巴管畸形的診斷，且病變以血管瘤為主。西地那非是一種磷酸二酯酶-5(phosphodiesteraseisoform-5，PDE-5)抑制劑，因而我們推測(cè)可能西地那非是通過(guò)抑制PDE-5的作用使該病變縮小的。在此啟發(fā)下，我們通過(guò)免

5、疫組織化學(xué)的方法研究了PDE-5在靜脈畸形、動(dòng)靜脈畸形、淋巴管畸形、血管瘤組織中的表達(dá)。結(jié)果表明PDE-5在血管瘤組織中呈陽(yáng)性表達(dá)，在其它脈管畸形組織中無(wú)表達(dá)。因此，我們認(rèn)為西地那非是對(duì)血管瘤而不是淋巴管畸形起作用。目前很多文獻(xiàn)證實(shí)西地那非可增強(qiáng)某些類(lèi)型的惡性腫瘤化療效果并對(duì)血管平滑肌、肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞等有抗增殖及促進(jìn)凋亡的作用。因此，我們通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究西地那非對(duì)血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞(HemECs)增殖及凋亡的影響，并對(duì)其相關(guān)機(jī)制進(jìn)行探

6、討。
　　目的
　　1.檢測(cè)PDE-5在血管瘤及各種脈管畸形組織中的表達(dá)。
　　2.研究西地那非對(duì)人源性HemECs的增殖和凋亡的影響。
　　3.研究西地那非對(duì)HemECs的增殖和凋亡作用與DNA分化抑制因子-1(Id-1)表達(dá)的關(guān)系，探討該藥的作用機(jī)制。
　　方法
　　1.收集山東大學(xué)齊魯醫(yī)院病理科2000-2013年血管瘤及脈管畸形組織塊，通過(guò)免疫組織化學(xué)的方法分別檢測(cè)石蠟包埋的10例淋巴管畸形、

7、8例增殖期血管瘤、
　　2例消退期血管瘤、10例靜脈畸形以及10例動(dòng)靜脈畸形組織塊中PDE-5的表達(dá)。血管瘤及脈管畸形的診斷是依據(jù)患者病史、體格檢查、MRI表現(xiàn)以及最后的病理結(jié)果確定的。淋巴管內(nèi)皮透明質(zhì)酸受體-1(LYVE-1)、細(xì)胞膜表面分化抗原34(CD34)和葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-1(GLUT-1)分別作為淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞和血管瘤組織的特異性標(biāo)記物。隨后對(duì)PDE-5在血管瘤及各種脈管畸形組織的表達(dá)進(jìn)行了檢測(cè)。本研究通過(guò)

8、了山東大學(xué)齊魯醫(yī)院醫(yī)院倫理委員會(huì)授權(quán)，所有患者或監(jiān)護(hù)人均知情同意。
　　2.收集山東大學(xué)齊魯醫(yī)院手術(shù)切除并經(jīng)病理證實(shí)為血管瘤組織標(biāo)本，利用組織塊貼壁培養(yǎng)法分離并培養(yǎng)HemECs。通過(guò)免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)第八因子相關(guān)抗原因子vWF、CD34和PDE-5在HemECs中的表達(dá)。體外以梯度濃度西地那非(0μM，1μM，3μM，5μM，10μM和15μM)處理HemECs24 h、48 h和72 h后，MTT法檢測(cè)細(xì)胞的增殖能力。以梯度濃度

9、的西地那非(0，1，5，10，15μM)處理HemECs，20分鐘后分別加入50 ng/ml bFGF、50 ng/ml VEGF。繼續(xù)孵箱培育24 h。MTT法檢測(cè)西地那非對(duì)bFGF及VEGF誘導(dǎo)的HemECs增殖的影響。HemECs分別經(jīng)對(duì)照組（0μM）、5μM西地那非處理24 h后，采用流式細(xì)胞Annexin-V/PI staining assay檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。
　　3.組織塊培養(yǎng)法獲得的HemECs分別經(jīng)OμM（對(duì)照組）

10、、5μM（實(shí)驗(yàn)組）西地那非處理24 h后，用TRI法提取細(xì)胞總RNA并逆轉(zhuǎn)錄成Id-1 cDNA，再通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量RFQ-PCR擴(kuò)增cDNA，利用比較Ct值法(2ˉ△△Ct)計(jì)算Id-1基因和內(nèi)參照基因閾值循環(huán)數(shù)差異，檢測(cè)兩組HemECs中Id-1基因的相對(duì)mRNA表達(dá)量。HemECs分別經(jīng)0μM（對(duì)照組）、5μM（實(shí)驗(yàn)組）西地那非處理24 h后，提取細(xì)胞總蛋白，通過(guò)免疫印跡法(western blot)檢測(cè)兩組HemECs中Id-1

11、蛋白的表達(dá)水平，人舌鱗癌TCA8113細(xì)胞系作為Id-1蛋白表達(dá)的陽(yáng)性對(duì)照。
　　結(jié)果
　　1.免疫組織化學(xué)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)CD34、LYVE-I和GLUT-1分別作為血管內(nèi)皮細(xì)胞、淋巴管畸形組織和血管瘤組織的特異性標(biāo)記物表達(dá)均陽(yáng)性。PDE-5表達(dá)在血管瘤組織HemECs胞漿內(nèi)，但在淋巴管畸形、動(dòng)靜脈畸形、靜脈畸形組織中均無(wú)表達(dá)。
　　2.MTT法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)在西地那非濃度為5μM時(shí)，24 h后與對(duì)照組（0μM）相比開(kāi)始出現(xiàn)顯著差

12、異(t=3.220，P＜0.01)，出現(xiàn)明顯的細(xì)胞抑制現(xiàn)象，且隨時(shí)間延長(zhǎng)抑制作用逐漸加強(qiáng)。西地那非作用于HemECs72 h時(shí)細(xì)胞的增殖活性與48 h相比無(wú)明顯差異（P＞0.05）。在檢測(cè)西地那非對(duì)bFGF及VEGF誘導(dǎo)的HemECs增殖的抑制作用時(shí)，西地那非濃度為5μM時(shí)，對(duì)bFGF及VEGF誘導(dǎo)的HemECs增殖也出現(xiàn)明顯的細(xì)胞抑制現(xiàn)象（P＜0.05），且隨時(shí)間延長(zhǎng)抑制作用逐漸加強(qiáng)。然而，當(dāng)西地那非濃度為15μM時(shí)，與濃度為10μM

13、相比對(duì)HemECs的增殖抑制作用無(wú)明顯差別(P＞0.05)。因此，濃度為5μM和作用時(shí)間為24 h分別是西地那非抑制HemECs的最適有效濃度和最適有效作用時(shí)間。用5μM西地那非處理HemECs24 h后，在光學(xué)顯微鏡下可見(jiàn)到HemECs隨著細(xì)胞間連接的破壞和胞漿內(nèi)不斷增加的顆粒，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生了改變。流式細(xì)胞學(xué)分析結(jié)果表明5μM西地那非處理HemECs24 h后凋亡率為10.5％，高于對(duì)照組(2.53％)。因此，體外實(shí)驗(yàn)中濃度5μM的西

14、地那非處理24 h后顯著抑制了HemECs的增殖并促進(jìn)了其凋亡。
　　3.通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量RFQ-PCR方法，根據(jù)2-△△ct公式，用5μM西地那非處理HemECs24 h后，細(xì)胞內(nèi)Id-1的mRNA相對(duì)表達(dá)量減少了44.2％，(t=9.749，df=4，P=0.0006＜0.01）。根據(jù)Western blot實(shí)驗(yàn)取得的免疫印跡條帶的灰度值比較分析，用5μM西地那非處理HemECs24 h后，細(xì)胞內(nèi)Id-1的蛋白表達(dá)也降低。