西地那非對血管瘤內(nèi)皮細胞增殖和凋亡的影響及機制探討.pdf

1、研究背景
　　血管瘤(hemangiomas)是發(fā)生在嬰幼兒的血管源性良性腫瘤，發(fā)病率高達10～12％，絕大多數(shù)在出生時或出生后不久發(fā)現(xiàn)，大部分可自行消退，但仍有20％的血管瘤不能消退。根據(jù)病變發(fā)展過程可分為增殖期、消退期和消退完成期。血管瘤雖然屬于良性腫瘤，但發(fā)生在口腔頜面及頸部的病變，不僅嚴重影響面容美觀，還可能由于病變阻塞呼吸道、消化道而影響發(fā)音、進食，甚至導致局部出血、窒息并危及生命。因此目前主張對該病應積極進行早期治療。

2、血管瘤常用的治療方法有藥物治療、激光、手術(shù)切除、冷凍以及硬化治療等。冷凍、激光及硬化治療易導致增生或萎縮性瘢痕、色素沉著或色素減退等，手術(shù)切除僅適用于局限性的血管瘤的治療。藥物治療則是一種治療早期血管瘤安全、有效的方法。治療血管瘤的藥物有多種，目前國內(nèi)外常用藥物包括以下幾類:1.β-腎上腺素受體阻滯劑，以普萘洛爾(propranolol)為主;2.皮質(zhì)類固醇激素，以潑尼松(prednisolone)為主;3.其它:α-干擾素(IFN-α

3、)、咪喹莫特(Imiquimod)、抗腫瘤藥環(huán)磷酰胺(CTX)及長春新堿(VCR)等。2008年，在《新英格蘭醫(yī)學雜志》上，Leaute-LabrezeC等首次報道口服普萘洛爾引起了鼻咽部血管瘤的消退。近年來，口服普萘洛爾逐漸成為治療血管瘤的一線藥物。
　　2012年，Swetman等首次報道口服西地那非(sildenafil)治療3名淋巴管畸形患兒后病變顯著消退，發(fā)表于《新英格蘭醫(yī)學雜志》上，提示西地那非可作為治療淋巴管畸形的一

4、種新型藥物。但該文章僅展示了患兒病變部位的照片和核磁共振平片(magnetic resonance imaging，MRI)，病變均未經(jīng)手術(shù)及病理證實為淋巴管畸形。根據(jù)MRI表現(xiàn)，我們認為此患兒更符合血管瘤伴發(fā)淋巴管畸形的診斷，且病變以血管瘤為主。西地那非是一種磷酸二酯酶-5(phosphodiesteraseisoform-5，PDE-5)抑制劑，因而我們推測可能西地那非是通過抑制PDE-5的作用使該病變縮小的。在此啟發(fā)下，我們通過免

5、疫組織化學的方法研究了PDE-5在靜脈畸形、動靜脈畸形、淋巴管畸形、血管瘤組織中的表達。結(jié)果表明PDE-5在血管瘤組織中呈陽性表達，在其它脈管畸形組織中無表達。因此，我們認為西地那非是對血管瘤而不是淋巴管畸形起作用。目前很多文獻證實西地那非可增強某些類型的惡性腫瘤化療效果并對血管平滑肌、肺動脈內(nèi)皮細胞等有抗增殖及促進凋亡的作用。因此，我們通過體外實驗進一步研究西地那非對血管瘤內(nèi)皮細胞(HemECs)增殖及凋亡的影響，并對其相關(guān)機制進行探

6、討。
　　目的
　　1.檢測PDE-5在血管瘤及各種脈管畸形組織中的表達。
　　2.研究西地那非對人源性HemECs的增殖和凋亡的影響。
　　3.研究西地那非對HemECs的增殖和凋亡作用與DNA分化抑制因子-1(Id-1)表達的關(guān)系，探討該藥的作用機制。
　　方法
　　1.收集山東大學齊魯醫(yī)院病理科2000-2013年血管瘤及脈管畸形組織塊，通過免疫組織化學的方法分別檢測石蠟包埋的10例淋巴管畸形、

7、8例增殖期血管瘤、
　　2例消退期血管瘤、10例靜脈畸形以及10例動靜脈畸形組織塊中PDE-5的表達。血管瘤及脈管畸形的診斷是依據(jù)患者病史、體格檢查、MRI表現(xiàn)以及最后的病理結(jié)果確定的。淋巴管內(nèi)皮透明質(zhì)酸受體-1(LYVE-1)、細胞膜表面分化抗原34(CD34)和葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白-1(GLUT-1)分別作為淋巴管內(nèi)皮細胞、血管內(nèi)皮細胞和血管瘤組織的特異性標記物。隨后對PDE-5在血管瘤及各種脈管畸形組織的表達進行了檢測。本研究通過

8、了山東大學齊魯醫(yī)院醫(yī)院倫理委員會授權(quán)，所有患者或監(jiān)護人均知情同意。
　　2.收集山東大學齊魯醫(yī)院手術(shù)切除并經(jīng)病理證實為血管瘤組織標本，利用組織塊貼壁培養(yǎng)法分離并培養(yǎng)HemECs。通過免疫細胞化學法檢測第八因子相關(guān)抗原因子vWF、CD34和PDE-5在HemECs中的表達。體外以梯度濃度西地那非(0μM，1μM，3μM，5μM，10μM和15μM)處理HemECs24 h、48 h和72 h后，MTT法檢測細胞的增殖能力。以梯度濃度

9、的西地那非(0，1，5，10，15μM)處理HemECs，20分鐘后分別加入50 ng/ml bFGF、50 ng/ml VEGF。繼續(xù)孵箱培育24 h。MTT法檢測西地那非對bFGF及VEGF誘導的HemECs增殖的影響。HemECs分別經(jīng)對照組（0μM）、5μM西地那非處理24 h后，采用流式細胞Annexin-V/PI staining assay檢測細胞凋亡率。
　　3.組織塊培養(yǎng)法獲得的HemECs分別經(jīng)OμM（對照組）

10、、5μM（實驗組）西地那非處理24 h后，用TRI法提取細胞總RNA并逆轉(zhuǎn)錄成Id-1 cDNA，再通過實時熒光定量RFQ-PCR擴增cDNA，利用比較Ct值法(2ˉ△△Ct)計算Id-1基因和內(nèi)參照基因閾值循環(huán)數(shù)差異，檢測兩組HemECs中Id-1基因的相對mRNA表達量。HemECs分別經(jīng)0μM（對照組）、5μM（實驗組）西地那非處理24 h后，提取細胞總蛋白，通過免疫印跡法(western blot)檢測兩組HemECs中Id-1

11、蛋白的表達水平，人舌鱗癌TCA8113細胞系作為Id-1蛋白表達的陽性對照。
　　結(jié)果
　　1.免疫組織化學檢測發(fā)現(xiàn)CD34、LYVE-I和GLUT-1分別作為血管內(nèi)皮細胞、淋巴管畸形組織和血管瘤組織的特異性標記物表達均陽性。PDE-5表達在血管瘤組織HemECs胞漿內(nèi)，但在淋巴管畸形、動靜脈畸形、靜脈畸形組織中均無表達。
　　2.MTT法檢測發(fā)現(xiàn)在西地那非濃度為5μM時，24 h后與對照組（0μM）相比開始出現(xiàn)顯著差

12、異(t=3.220，P＜0.01)，出現(xiàn)明顯的細胞抑制現(xiàn)象，且隨時間延長抑制作用逐漸加強。西地那非作用于HemECs72 h時細胞的增殖活性與48 h相比無明顯差異（P＞0.05）。在檢測西地那非對bFGF及VEGF誘導的HemECs增殖的抑制作用時，西地那非濃度為5μM時，對bFGF及VEGF誘導的HemECs增殖也出現(xiàn)明顯的細胞抑制現(xiàn)象（P＜0.05），且隨時間延長抑制作用逐漸加強。然而，當西地那非濃度為15μM時，與濃度為10μM

13、相比對HemECs的增殖抑制作用無明顯差別(P＞0.05)。因此，濃度為5μM和作用時間為24 h分別是西地那非抑制HemECs的最適有效濃度和最適有效作用時間。用5μM西地那非處理HemECs24 h后，在光學顯微鏡下可見到HemECs隨著細胞間連接的破壞和胞漿內(nèi)不斷增加的顆粒，細胞形態(tài)發(fā)生了改變。流式細胞學分析結(jié)果表明5μM西地那非處理HemECs24 h后凋亡率為10.5％，高于對照組(2.53％)。因此，體外實驗中濃度5μM的西

14、地那非處理24 h后顯著抑制了HemECs的增殖并促進了其凋亡。
　　3.通過實時熒光定量RFQ-PCR方法，根據(jù)2-△△ct公式，用5μM西地那非處理HemECs24 h后，細胞內(nèi)Id-1的mRNA相對表達量減少了44.2％，(t=9.749，df=4，P=0.0006＜0.01）。根據(jù)Western blot實驗取得的免疫印跡條帶的灰度值比較分析，用5μM西地那非處理HemECs24 h后，細胞內(nèi)Id-1的蛋白表達也降低。