溫?zé)釋?duì)尖銳濕疣組織中HPV早期基因、干擾素及其相關(guān)信號(hào)途徑的影響.pdf

1、人類乳頭瘤病毒(human papilloma virus,HPV)是乳多空病毒科多瘤病毒亞科的一組嗜黏膜和皮膚上皮的雙鏈環(huán)狀DNA病毒,其感染靶器官主要為上皮組織,顯示高度的宿主特異性,對(duì)人體特異部位的上皮細(xì)胞具親和力。HPV感染可以引起皮膚粘膜的良性增生性病變?nèi)琊?甚至引起惡性腫瘤的發(fā)生?，F(xiàn)已鑒定出120余種HPV基因型?，F(xiàn)階段臨床治療上主要采用理化(如冷凍、電灼術(shù)、高熱激光、化學(xué)腐蝕)、細(xì)胞毒類藥物等創(chuàng)傷性方法治療疣。由于感染局部

2、免疫缺陷以及缺乏有效的特異性抗病毒制劑和徹底根治的物理方法,導(dǎo)致感染遷延不愈。隨著熱療的生理和病理生理學(xué)研究逐步深入,以及測溫、控溫和加溫技術(shù)的不斷進(jìn)步,熱療得到了迅速的發(fā)展。在過去的幾十年內(nèi),溫?zé)嵩糜谥委焺?dòng)物和人類多種表淺和深層的良惡性腫瘤。我國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)有成功利用灸烤療法治療疣的經(jīng)驗(yàn)。國外有一些臨床報(bào)告,初步觀察到溫?zé)釋?duì)尋常疣、跖疣有較好的治療效果。我們采用自行研究的遠(yuǎn)紅外加熱儀在42-45℃溫?zé)釛l件下照射20-30分鐘治療疣,取得

3、滿意的療效。
　　 有研究認(rèn)為溫?zé)嵋鸩∽兘M織壞死,物理性地去除了HPV病毒,如同其它破壞性物理治療手段一樣,也可能是由于溫?zé)嶂苯右鸩《酒茐幕蛘呤怯捎谘装Y反應(yīng)導(dǎo)致病毒的去除。王曉琴等研究表明溫?zé)峥纱龠M(jìn)尖銳濕疣及正常皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞的凋亡,并呈溫度依賴性,尖銳濕疣角質(zhì)形成細(xì)胞與正常角質(zhì)形成細(xì)胞相比對(duì)溫?zé)岣舾?。?xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答是HPV感染角質(zhì)形成細(xì)胞清除及疣體消退的主要因素,李曉東等研究表明溫?zé)崮軌虼龠M(jìn)朗格漢斯細(xì)胞(Lange

4、rhans cell,LC)成熟,促進(jìn)LC的遷移和增強(qiáng)抗原提呈能力,LC通過真皮向局部淋巴結(jié)遷移,在局部細(xì)胞免疫應(yīng)答中發(fā)揮作用。
　　 HPV在56℃30分鐘的條件下才能滅活,所以溫?zé)岬淖饔?39-45℃)并不是對(duì)病毒的直接殺滅,但溫?zé)崾欠衲芤种艸PV的某些活性成分(如E6、E7基因表達(dá))并作為局部溫?zé)嶂委燄嗟臋C(jī)制之一,目前尚不清楚。干擾素(Interferon,IFN)家族是在抗病毒過程中誘導(dǎo)的分泌型蛋白,主要分為Ⅰ型IFN(

5、包括IFN-α、-β)與Ⅱ型IFN(IFN-γ),IFN通過與細(xì)胞表面的受體結(jié)合從而觸發(fā)JAK-STAT信號(hào)途徑活化進(jìn)而誘導(dǎo)下游蛋白酶轉(zhuǎn)錄表達(dá),從而發(fā)揮抗病毒生物學(xué)活性。有研究表明溫?zé)崮苷T導(dǎo)IFN表達(dá)增加,Taylor等報(bào)道將EB病毒轉(zhuǎn)染的B細(xì)胞系置于42℃培養(yǎng)條件下,取上清液進(jìn)行抗病毒活性檢測,發(fā)現(xiàn)該上清液極大的提升了Hep-2細(xì)胞對(duì)抗水皰性口炎病毒(Vesicular stomatitis virus,vsv)感染的能力,經(jīng)鑒定發(fā)現(xiàn)

6、,上清液中發(fā)揮抗病毒作用的是IFN-γ。Taylor發(fā)現(xiàn)溫?zé)嵴T導(dǎo)IFN表達(dá)的現(xiàn)象只存在于轉(zhuǎn)染病毒的細(xì)胞系中,而未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系經(jīng)溫?zé)崽幚砗笪从^察到相似現(xiàn)象。溫?zé)嵊绊慖FN表達(dá)和釋放的同時(shí),對(duì)其生物學(xué)活性也產(chǎn)生一定的影響。Payne等報(bào)道溫?zé)針O大地提高了人IFN-α,-β,-γ,及鼠IFN-γ的抗病毒活性。
　　 我們通過檢測:1、溫?zé)釋?duì)HPV基因產(chǎn)物表達(dá)(E6/E7)的影響;2、溫?zé)崽幚砗蟾蓴_素及其誘導(dǎo)的下游蛋白酶表達(dá)變化;3、溫

7、熱處理后IFN-α/β受體及其相關(guān)JAK-STAT信號(hào)途徑中信號(hào)分子表達(dá)變化,探討溫?zé)釋?duì)HPV感染的抑制及抗病毒免疫活性研究,為臨床治療疣提供穩(wěn)定、可靠的理論依據(jù)。本研究中,我們采用尖銳濕疣組織標(biāo)本作為病毒載體,利用溫?zé)嶂委焹x進(jìn)行不同溫度照射,采用器官培養(yǎng)的模式,模擬體內(nèi)環(huán)境,開展相關(guān)實(shí)驗(yàn),報(bào)道如下:
　　 材料與方法
　　 一、材料
　　 臨床資料:女性尖銳濕疣(Condyloma acuminatum,CA)

8、患者均為我院皮膚科、婦科門診患者,符合2000年衛(wèi)生部防疫司制訂的CA診斷標(biāo)準(zhǔn)。
　　 對(duì)照組:正常皮膚取自整形術(shù)后。
　　 二、標(biāo)本處理：征得患者知情同意后,局部消毒麻醉,分別切取疣體/正常皮膚組織,每例組織等分為4份。其中一份OTC包埋劑包埋后直接冷凍保存,另3份真皮側(cè)向下,放入少量RPMI-1640培養(yǎng)液,只將疣體底部浸于培養(yǎng)液中分別以37℃、42℃和45℃三種溫度照射30分鐘后,將疣體全部浸于RPMI-1640培

9、養(yǎng)液,37℃培養(yǎng)箱孵育12小時(shí)后將組織取出,OCT包埋劑包埋后冷凍保存。
　　 三、HPV型別鑒定檢測：采用TaKaRa公司的Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.3.0 DNA純化試劑盒提取DNA,采用HPV6/11型特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,采用1.5％瓊脂糖凝膠電泳,紫外凝膠成像系統(tǒng)拍照記錄結(jié)果。
　　 四、HPV E6/E7 mRNA的檢測：采用熒光實(shí)時(shí)定量PCR方法檢

10、測HPV-6 E6/E7,HPV-11 E6/E7 mRNA的表達(dá)。按Trnzol試劑說明書提取總RNA;用TIANScript M-MLV試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA;SYBR-Green法進(jìn)行熒光實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增,采用雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法進(jìn)行相對(duì)定量分析。
　　 五、干擾素、下游蛋白酶及JAK-STAT途徑相關(guān)信號(hào)分子mRNA的表達(dá)：IFN-α、-β、-γ,PKR,OAS1,IFNAR1,IFNAR2,Jak1,Tyk2,Stat1,

11、Stat2mRNA在不同溫?zé)釛l件處理后表達(dá)水平變化。方法同三。
　　 六、Western blot檢測蛋白表達(dá)水平：組織提取總蛋白,BCA法檢測蛋白質(zhì)含量。進(jìn)行SDS-PAGE電泳,轉(zhuǎn)印至PVDF膜、封閉,PKR,OAS1,p-Stat1,Stat1,p-Stat2,Stat2、β-actin一抗孵育過夜,相應(yīng)的二抗孵育,增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光(enhance chemiluminescence,ECL),拍照,以β-actin為內(nèi)參照

12、,條帶進(jìn)行灰度值分析。
　　 七、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件包對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,數(shù)據(jù)結(jié)果以x±SE表示,以P＜0.05為判斷差異顯著性標(biāo)準(zhǔn)。組間比較采用方差分析。P＜0.05被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果
　　 一、HPV E6/E7 mRNA在溫?zé)崽幚砗蟊磉_(dá)變化E6、E7 mRNA表達(dá)均隨局部溫度升高而逐漸減少。HPV-6 E6 mRNA的相對(duì)表達(dá)量分別為:37℃(1.00±0.00),42

13、℃(0.61±0.17),45℃(0.27±0.15);HPV-6E7 mRNA的相對(duì)表達(dá)量分別為:37℃(1.00±0.00),42℃(0.56±0.21),45℃(0.16±0.11);HPV-11 E6 mRNA的相對(duì)表達(dá)量分別為:37℃(1.00±0.00),42℃(0.60±0.22),45℃(0.16±0.08);HPV-11 E7 mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為:37℃(1.00±0.00),42℃(0.55±0.15),45℃

14、(0.24±0.06)。組間比較有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.001)。
　　 二、溫?zé)崽幚砗蟾蓴_素及其誘導(dǎo)的下游蛋白酶表達(dá)變化溫?zé)崽幚砗?CA組織IFN-α、IFN-β、IFN-γ轉(zhuǎn)錄水平隨溫度升高表達(dá)明顯升高。IFN-α在42℃和45℃溫?zé)嶙饔孟卤磉_(dá)水平與對(duì)照組相比分別增加了2-5倍和3-6倍,IFN-β表達(dá)水平分別增加了2-4倍和3-4倍,IFN-γ表達(dá)水平增加了2-5倍4-14倍。CA組織中感染HPV型別與干擾素誘導(dǎo)水平之

15、間無顯著相關(guān)性。
　　 OAS1轉(zhuǎn)錄水平在42℃和45℃溫?zé)嶙饔孟卤磉_(dá)水平與對(duì)照組相比分別增加5倍和11倍左右;其蛋白表達(dá)水平在42℃和45℃溫?zé)嶙饔孟戮黾恿?-2倍。PKR轉(zhuǎn)錄水平在42℃溫?zé)嶙饔孟卤磉_(dá)水平與對(duì)照組相比增加3倍,但在45℃條件時(shí)表達(dá)水平降低了1/3;其蛋白表達(dá)水平在42℃和45℃溫?zé)嶙饔孟戮黾恿?-2倍。上述指標(biāo)在正常皮膚組織中未見顯著性改變。
　　 三、溫?zé)崽幚砗驣FN-α/β受體及其相關(guān)JAK-

16、STAT信號(hào)途徑中分子表達(dá)變化CA組織中IFNAR1在42℃和45℃溫?zé)嶙饔孟卤磉_(dá)水平與對(duì)照組相比分別增加了2-3倍和3-5倍,IFNAR2表達(dá)水平則分別增加了2-3倍和2-4倍。Jak1,Tvk2,Stat1和Stat2轉(zhuǎn)錄水平在42℃和45℃溫?zé)嶙饔孟聸]有發(fā)生顯著性改變。P-Stat1蛋白表達(dá)水平在42℃和45℃溫?zé)嶙饔孟卤磉_(dá)水平與對(duì)照組相比均增加了1-2倍(P＜0.001);p-Stat2在42℃和45℃溫?zé)嶙饔孟卤磉_(dá)水平分別增加

17、了1.5倍(P＜0.001)和1.8倍(P＜0.001)。正常皮膚組織在溫?zé)嶙饔们昂笊鲜鲋笜?biāo)均未見顯著性差異。
　　 結(jié)論
　　 1、溫?zé)釋?duì)HPV-6E6、HPV-6E7、HPV-11E6及HPV-11E7 mRNA表達(dá)存在抑制作用,表現(xiàn)為這四種基因mRNA表達(dá)隨著溫度的升高而降低。
　　 2、溫?zé)崮苷T導(dǎo)HPV感染組織中三種干擾素(IFN-α、IFN-β、IFN-γ)表達(dá)增加,這種誘導(dǎo)作用是呈正相關(guān)的,即溫度越高

18、,干擾素表達(dá)水平越高。CA組織中感染HPV型別與干擾素誘導(dǎo)水平之間無顯著相關(guān)性。干擾素相關(guān)蛋白酶OAS1轉(zhuǎn)錄水平及蛋白水平均隨著溫度的升高而升高,PKR轉(zhuǎn)錄水平在45℃時(shí)表達(dá)有所下降,但蛋白表達(dá)水平仍明顯升高。干擾素、OAS1及PKR表達(dá)上調(diào)有利于抑制HPV的復(fù)制及播散。溫?zé)嶙饔煤笳Ｆつw組織中上述指標(biāo)未見顯著性改變,因此推測溫?zé)釋?duì)干擾素及其相關(guān)蛋白酶表達(dá)的調(diào)節(jié)作用可能僅限于病毒感染組織。
　　 3、溫?zé)嶙饔煤蟾蓴_素受體表達(dá)上調(diào)