血-視網(wǎng)膜屏障細胞培養(yǎng)中探索HIV-1gp120的毒性及APOBEC3的分子機制.pdf

1、本課題研究的4個部分具體內(nèi)容，簡述如下： 第一部分人類血—視網(wǎng)膜屏障細胞的分離、培養(yǎng)及細胞免疫化學(xué)特征的鑒定 目的： 本部分的目的在于探索分離、培養(yǎng)出3種HBRBCs的最佳方法，同時進行相關(guān)細胞的免疫化學(xué)特征鑒定，為進行人類血—視網(wǎng)膜屏障疾病的相關(guān)研究提供良好的平臺。 方法： 1.人類血—視網(wǎng)膜屏障細胞的分離和培養(yǎng)：取新鮮尸體眼球，分離出視網(wǎng)膜神經(jīng)層和視網(wǎng)膜色素上皮層，經(jīng)過特定的組織消化和細胞分離

2、方法，使用不同的選擇性培養(yǎng)基分別培養(yǎng)出人類視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細胞、人類視網(wǎng)膜微血管周細胞和人類視網(wǎng)膜色素上皮細胞。 2.HBRBCs的免疫化學(xué)特征鑒定：用第Ⅷ因子和ZO-1相關(guān)抗原抗體免疫組化鑒定所獲得的HRCECs；用兔抗人膠質(zhì)纖維酸性蛋白多克隆抗體和細胞骨架結(jié)構(gòu)蛋白鑒定HRCPCs；用兔抗人角蛋白多克隆抗體鑒定HRPECs。 3.用CD4，CXCR4和CCR5單克隆抗體鑒定HRCECs和HRCPCs的HIV-1 gp1

3、20相關(guān)受體表達。 結(jié)果： 1、應(yīng)用不同的選擇性培養(yǎng)液和培養(yǎng)技巧，成功地分離、培養(yǎng)了純度較高的3種HBRBCs： HRCECs、HRCPCs、HRPECs。 2、體外培養(yǎng)的3種HBRBCs可表達各自特征性的蛋白：HRCECs可表達Ⅷ因子和ZO-1緊密連接蛋白，HRCPCs可表達GFAP和α—actin蛋白，HRPECs可表達keratin蛋白。 3、HRCECs的HIV-1 gp120相關(guān)受體表達情況：C

4、D4受體為陰性，CXCR4和CCR5為陽性，在細胞漿內(nèi)和細胞膜上均有分布；而HRCPCs的3種受體表達均為陰性。 結(jié)論： 應(yīng)用不同的選擇性培養(yǎng)液和培養(yǎng)技巧，是有效、簡便可行的HBRBCs的系統(tǒng)培養(yǎng)分離方法；3種HBRBCs的HIV-1 gp120相關(guān)受體表達情況的探明，為進一步探討HIV侵犯血—視網(wǎng)膜屏障的機制提供了實驗基礎(chǔ)。 第二部分玻璃體對人類血-視網(wǎng)膜屏障細胞原代培養(yǎng)的影響 目的： 探討玻璃

5、體液對培養(yǎng)的人視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細胞和色素上皮細胞增生的影響。 方法： 1、人玻璃體液制備：玻璃體來源和細胞原代培養(yǎng)取材同時獲得，無菌條件下沿赤道部環(huán)形剪開眼球，用針將玻璃體撥入小燒杯中，且視網(wǎng)膜及色素組織已分離完全取出。10ml空針抽吸玻璃體多次，0.22μm微孔濾膜過濾，以上操作均在冰浴條件下進行，濾液無菌保存于低溫冰箱備用。 2、采用原代培養(yǎng)的第三代HRCECs和HRPECs，分別培養(yǎng)在1:8、1:4、1:2

6、的VCM中，其中VCM分為有無血清2組，在不同作用時間，采用四唑鹽比色法檢測VCM對人HRCECs和RPE細胞增生的影響。 結(jié)果： 1、在有血清時，與對照組比較，1:4、1:2的VCM在培養(yǎng)的各時間段對HRCECs的抑增生作用差異有顯著性意義，而對RPE細胞和混合細胞的促增生作用差異有非常顯著性意義。 2、在無血清時與對照組比較，1:4VCM組在培養(yǎng)60、72h時以及1:2VCM組在培養(yǎng)24h，HRPECs細胞的

7、增生差異有顯著性意義，而1:2VCM組在培養(yǎng)48、60、72h時HRPECs的增生差異有非常顯著性意義；1:2VCM組在培養(yǎng)各時間段混合細胞的增生差異有顯著性意義，均表現(xiàn)為促增生效應(yīng)。 結(jié)論： 一定體積分數(shù)的人VCM抑制HRCECs的增生，但明顯促進人RPE細胞以及混合細胞的增生，提示玻璃體中HRPECs細胞浸潤是加重外傷增生性玻璃體視網(wǎng)膜病變和眼內(nèi)血管增生性疾病的高危因素。 第三部分HIV-1 gp120對人類

8、血，視網(wǎng)膜屏障細胞的影響及其分子機制 目的： 觀察HIV-1 gp120對HBRBCs的增殖、凋亡和細胞結(jié)構(gòu)的影響，探索在HIV-1相關(guān)眼病病變過程中HIV-1 gp120對血—視網(wǎng)膜內(nèi)屏障破壞的可能機制。 方法： 1、選用并先測定3-4代的HBRBCs的細胞生長曲線。 2、HIV-1 gp120蛋白溶液的配制和分組：取2ug的gp120以無血清培養(yǎng)液稀釋為0.01、0.02、0.04、0.08、

9、0.1、0.12、0.15μg/ml的HIV-1gp120溶液培養(yǎng)24小時，每個濃度為一組，共7個實驗組；或以0.08μg/ml HIV-1gp120溶液培養(yǎng)分別培養(yǎng)4、8、12、24、48、72小時，每個時間為一組，共6個實驗組；同時均以無血清培養(yǎng)基為對照組。 3、用MTT法觀察gp120蛋白液不同濃度和不同作用時間對原代細胞的生長抑制作用。 4、并用Annexin V—FITC/PI雙標記和rhodamine123標

10、記線粒體膜電位，流式細胞儀檢測gp120對細胞凋亡率和△ψm的影響。 5、用Western—blot檢測Cleaved caspase—9蛋白的活化情況。 6、并用透射電鏡觀察經(jīng)gp120處理前后原代細胞超微結(jié)構(gòu)的變化。 結(jié)論： HIV-1 gp120能夠抑制人血—視網(wǎng)膜屏障細胞的增殖并具有誘導(dǎo)凋亡的作用，通過破壞線粒體的結(jié)構(gòu)和功能是其可能的機制。 第四部分探索人類血—視網(wǎng)膜屏障細胞中IFN—A

11、POBEC3G信號通路 目的： 本部分檢測HBRBCs中APOBEC3家族的表達情況，分析其表達的多樣性，同時研究干擾素(IFN)—γ對APOBEC3G表達的影響，探索IFN—APOBEC3G信號通路能否為防止HIV等病毒破壞血—視網(wǎng)膜屏障并徹底清除病毒儲存庫提供有效策略。 方法： 1、HBRBCs的APOBEC3A—G基因的檢測：對3種HBRBCs進行總RNA的提取，cDNA第一鏈的合成，設(shè)計APOBE

12、C3A—G引物對，分別使用RT—PCR和real—time—PCR對APOBEC3A—G基因進行檢測。 2、HBRBCs中APOBEC3G/3F蛋白表達的檢測：采用了抗APOBEC3G和APOBEC3F的兔多克隆抗體，通過Western blot對HRCECs，HRCPCs，HRPECs、神經(jīng)上皮層、色素上皮層和全層視網(wǎng)膜組織中的APOBEC3G和APOBEC3F蛋白表達水平進行檢測。 3、IFN—γ對原代培養(yǎng)HRCEC

13、s的APOBEC3G表達的影響：使用了單劑量濃度漸增的IFN—γ(0，150，300，600和1200U/ml)對HRCECs進行干預(yù)培養(yǎng)后，分別將IFN—γ處理后不同時間點(6，12，24和48小時)的細胞溶解并采用Western—blot分析。 結(jié)果： 1、半定量的RT—PCR分析APOBEC3在HBRBCs的表達情況：所有的HBRBCs中都有很強的APOBEC3B，APOBEC3C，APOBEC3F和APOBEC3

14、G的mRNA表達，但沒有APOBE3A和APOBEC3D的mRNA表達。 2、Real—time PCR分析APOBEC3表達情況：APOBEC3B，APOBEC3C，APOBEC3F和APOBEC3G在HBRBCs中均有表達，但APOBE3A和APOBEC3D的表達陰性，這個結(jié)果印證了RT—PCR的結(jié)果。 3、Western blot分析APOBEC3G/3F蛋白的表達情況：所有的HBRBCs細胞中均有APOBEC3G

15、和APOBEC3F(～46kDa)的強烈蛋白表達。神經(jīng)上皮層、色素上皮層和全層視網(wǎng)膜組織中APOBEC3G和APOBEC3F蛋白也有表達，水平比HBRBCs高，而且色素上皮層檢驗到的信號比其它的組織層都高。 4、不同劑量的IFN—γ分析發(fā)現(xiàn)，使用單劑量300 U/ml IFN—γ處理HRCECs后，APOBEC3G蛋白表達水平在12小時內(nèi)便被提高了；當劑量增加到600U/ml時，IFN—γ誘導(dǎo)APBOBE3G蛋白表達的效應(yīng)最高，

16、大于此劑量濃度時，APBOBEC3G的蛋白水平便不再增加；更高劑量的IFN—γ，如1200U/ml來處理原代培養(yǎng)的HRCECs細胞，干擾素對細胞的任何毒性作用，細胞的形態(tài)和數(shù)量都保持正常。而不同的作用時間分析發(fā)現(xiàn)，300U/ml單劑量的IFN—γ在12小時內(nèi)增強APBOBE3G蛋白的表達，24小時內(nèi)表達量繼續(xù)上升，而到了48小時后就不再增加了。 結(jié)論： 1、HBRBCs中只有部分APOBEC3基因家族成員被檢測到，而且A