ADC病人HIV-1gp120基因多樣性分析及對(duì)U87細(xì)胞分泌TNF-α與IL-1β的影響.pdf

1、目的：
　　 影響ADC發(fā)病的主要因素有HIV-1病毒的致病性、機(jī)體的神經(jīng)易感性及免疫抑制的水平。研究表明大腦及腦脊液中HIV病毒載量與ADC的發(fā)生并非總是有關(guān),這說(shuō)明ADC的發(fā)生可能與HIV本身的基因及生物學(xué)活性有關(guān)。鑒于HIV-1gp120在病毒與宿主細(xì)胞結(jié)合和融合中發(fā)揮不可替代的作用,本研究的第一部分?jǐn)M通過(guò)對(duì)來(lái)源于2例ADC病人各6個(gè)組織的共60株HIV-1gp120序列進(jìn)行基因多樣性與生物學(xué)活性位點(diǎn)分析,對(duì)HIV-1gp

2、120基因多樣性和生物學(xué)活性與ADC發(fā)病的關(guān)系作出初步判斷。
　　 HIV-1致ADC發(fā)病的機(jī)制尚不清楚,但可以肯定的是它可以通過(guò)刺激膠質(zhì)細(xì)胞或巨噬細(xì)胞分泌細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β引起神經(jīng)元細(xì)胞損傷。鑒于HIV-1病毒載量與ADC的發(fā)生并非總是有關(guān),本研究的第二部分?jǐn)M通過(guò)分析不同病人不同組織來(lái)源基因不完全相同的HIV-1gp120誘導(dǎo)細(xì)胞分泌TNF-α、IL-1β的能力,來(lái)探討HIV-1gp120基因差異是否與其刺激細(xì)胞分

3、泌TNF-α、IL-1β的能力有關(guān),從而為ADC闡述發(fā)病機(jī)制提出新觀點(diǎn),為ADC的預(yù)防與控制提供新思路。
　　 方法
　　 1.以HIV-1B標(biāo)準(zhǔn)株HXB2 gp120基因序列基因組DNA序列作為模板,應(yīng)用Primer5.0軟件設(shè)計(jì)引物,巢式PCR法擴(kuò)增源自兩例ADC病人共12個(gè)不同組織的HIV-1gp120序列,PCR產(chǎn)物經(jīng)TA克隆后,轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α,經(jīng)藍(lán)白斑、氨芐青霉素篩選及測(cè)序后,每個(gè)部位選取5個(gè)HIV-1

4、gp120陽(yáng)性克隆進(jìn)行序列分析。通過(guò)對(duì)來(lái)自于兩例ADC病人不同組織的HIV-1gp120序列分別進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)、ds/dn比值、糖基化位點(diǎn)、V3環(huán)關(guān)鍵位點(diǎn)氨基酸等分析,以探討HIV-1gp120與ADC發(fā)病的關(guān)系。
　　 2.隨機(jī)選取源自兩例ADC病人外周組織、中樞神經(jīng)組織的HIV-1gp120克隆各一個(gè)(共4個(gè)克隆),PCR擴(kuò)增gp120基因,經(jīng)TA克隆、藍(lán)白斑及氨芐青霉素篩選,提取陽(yáng)性質(zhì)粒,雙酶切后的gp120片段與經(jīng)過(guò)同樣

5、雙酶切的逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體.MSCV-IRES-GFP連接,轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α,氨芐青霉素篩選HIV-1gp120陽(yáng)性表達(dá)載體,經(jīng)雙酶切和測(cè)序證實(shí)。然后將逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體與pUMVC、pCMV-VSV-G共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,免疫熒光顯微鏡觀察逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的表達(dá)、免疫組化實(shí)驗(yàn)檢測(cè)HW-1gp120的表達(dá)。收獲免疫熒光檢測(cè)陽(yáng)性的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒懸液,經(jīng)逐孔稀釋法測(cè)定其感染滴度,然后感染U87細(xì)胞,熒光顯微鏡檢測(cè)重組逆轉(zhuǎn)錄病毒蛋白的表達(dá),

6、免疫組化實(shí)驗(yàn)檢測(cè)HIV-1gp120的表達(dá),ELISA法測(cè)定細(xì)胞上清中TNF-α、IL-1β的含量,SPSS軟件分析測(cè)定結(jié)果。
　　 結(jié)果
　　 1.獲得了來(lái)源于兩例ADC病人各6個(gè)組織共60個(gè)HIV-1gp120陽(yáng)性克隆,并經(jīng)測(cè)序證實(shí),BLAST分析均為HIV-1Bgp120序列。
　　 2.構(gòu)建了每例ADC病人來(lái)源的各6個(gè)組織共30個(gè)HIV-1gp120基因克隆的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù),由系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)可見(jiàn),不同組織來(lái)源的H

7、W-1gp120基因位于不同的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)進(jìn)化枝上,不同組織來(lái)源的HIV-1gp120基因克隆也可以存在交叉現(xiàn)象。
　　 3.與HIV-1B標(biāo)準(zhǔn)株HXB2 gp120相比,第一例ADC病人來(lái)源的HIV-1gp120其各自的ds/dn=1.1744±0.0348(p＜0.001);第二例病人體內(nèi)來(lái)源的所有HIV-1gp120基因序列的ds/(dn=0.8222±0.2086(p＜0.001);兩個(gè)病例來(lái)源的HIV-1gp120基因序

8、列的ds/dn具有顯著性差別(p＜0.001)。
　　 4.以HIV-1B標(biāo)準(zhǔn)株HXB2gp120的糖基化位點(diǎn)為標(biāo)準(zhǔn),第一例ADC病人來(lái)源HIV-1gp120序列糖基化位點(diǎn)相對(duì)比較保守,第二例ADC病人來(lái)源的HIV-1gp20序列糖基化位點(diǎn)變異較大。
　　 5.根據(jù)現(xiàn)有的資料,可以預(yù)測(cè)感染兩例ADC病人大腦組織的HIV-1病毒均為CCR5受體使用型、巨噬細(xì)胞嗜性、非合胞體誘導(dǎo)型毒株。
　　 6.構(gòu)建了4個(gè)HW-1

9、包膜糖蛋白gp120的逆轉(zhuǎn)錄表達(dá)載體A1/MIG、B1/MIG、A2/MIG、B2/MIG,雙酶切鑒定目的片段和載體分別為1.44kb和6.8kb,并經(jīng)測(cè)序證實(shí)。對(duì)四個(gè)表達(dá)載體中的HIV-1gp120進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)四株HW-1gp120序列存在基因差異,其中A1/MIG的V3環(huán)序列與其他三株序列差異較大。
　　 7.熒光顯微鏡觀察結(jié)果顯示共轉(zhuǎn)染MSCV-IRES-GFP、pUMVC及pCMV-VSV-G的293T細(xì)胞及感染重組逆

10、轉(zhuǎn)錄病毒的U87細(xì)胞中均有綠色熒光信號(hào)產(chǎn)生。逐孔稀釋法測(cè)定重組逆轉(zhuǎn)錄病毒的滴度約為106/ml。
　　 8免疫組化實(shí)驗(yàn)顯示轉(zhuǎn)染A1/MIG、B1/MIG、A2/MIG、B2/MIG表達(dá)載體的293T細(xì)胞及感染HIV-1gp120陽(yáng)性重組逆轉(zhuǎn)錄病毒的U87細(xì)胞中均有HW-1gp120陽(yáng)性細(xì)胞出現(xiàn)。
　　 9.ELISA測(cè)定重組逆轉(zhuǎn)錄病毒感染細(xì)胞上清中TNF-α、IL-1β含量,發(fā)現(xiàn)HIV-1gp120陽(yáng)性重組逆轉(zhuǎn)錄病毒誘導(dǎo)

11、細(xì)胞分泌的TNF-α、IL-1β量高于HIV-1gp120陰性重組逆轉(zhuǎn)錄病毒(p＜0.001);第一例ADC病人外周組織來(lái)源的HIV-1gp120誘導(dǎo)細(xì)胞分泌TNF-α、IL-1β的量高于其它3個(gè)組織來(lái)源的HIV-1gp120(p＜0.001),而其他3個(gè)組織來(lái)源的HIV-1gp120誘導(dǎo)分泌的TNF-α、IL-1β的量差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＞0.10)。
　　 結(jié)論
　　 1.HIV-1 gp120的基因多樣性和生物學(xué)活