ADC病人HIV-1nef基因多樣性及其對(duì)U87細(xì)胞分泌TNF-α與IL-1β的影響.pdf

1、目的：
　　艾滋病癡呆綜合征(ADC)是艾滋病中最常見(jiàn)的神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥，一般晚期HIV感染者易患此病，是由人類免疫缺陷病毒(Ⅰ)型(HIV-1)侵犯中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)造成病人意識(shí)、行為和運(yùn)動(dòng)功能改變?yōu)橹饕憩F(xiàn)的綜合征。迄今為止，ADC的具體發(fā)病機(jī)制尚不清楚，但有多項(xiàng)研究證明HIV不能直接感染神經(jīng)元，而是通過(guò)感染腦組織內(nèi)的巨噬細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞，引發(fā)炎癥反應(yīng)釋放細(xì)胞因子及自由基，最終損傷大腦神經(jīng)元。HIV感染可使人神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)

2、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和白細(xì)胞介素(IL)等多種具有潛在神經(jīng)毒性作用的細(xì)胞因子，其中TNF-α、IL-1β是ADC發(fā)病過(guò)程中最重要的兩種，它們能提高血腦屏障的通透性以利于HIV-1感染的單核-巨噬細(xì)胞侵入大腦，增強(qiáng)病毒復(fù)制，還能與趨化因子共同作用擴(kuò)大炎癥反應(yīng)，損害神經(jīng)元。
　　HIV-1的早期基因負(fù)調(diào)控因子(Nef)是HIV-1調(diào)節(jié)蛋白之一，能夠下調(diào)病毒轉(zhuǎn)錄，延長(zhǎng)病毒壽命，增強(qiáng)病毒的復(fù)制能力和感染性，并干擾生長(zhǎng)因子介導(dǎo)的與

3、增殖、分化和凋亡有關(guān)的信號(hào)通路，促進(jìn)艾滋病病情的進(jìn)展。
　　HIV-1為逆轉(zhuǎn)錄病毒，具有高度的變異性，而HIV-1基因的變異很有可能與ADC的發(fā)病機(jī)制相關(guān)。為了探討ADC患者體內(nèi)HIV-1nef基因的變異，以及這種變異所引起的氨基酸位點(diǎn)改變及其與ADC之間的關(guān)系等，本論文對(duì)一例ADC病人的CNS和外周共5個(gè)部位來(lái)源的25株HIV-1nef全序列進(jìn)行了基因多樣性分析，并研究了nef基因變異導(dǎo)致的氨基酸位點(diǎn)的改變以及對(duì)U87細(xì)胞分泌T

4、NF-α、IL-1β的影響，為探討ADC的發(fā)病機(jī)制提供思路。
　　方法：
　　1.提取1例ADC病例尸檢標(biāo)本的CNS（基底核、額葉灰質(zhì)、腦膜、顳葉）和外周（脾）的共5個(gè)部位組織中的基因組DNA并以其為模板，PCR擴(kuò)增HIV-1nef基因全序列，PCR產(chǎn)物連接到pMD19-T克隆載體后轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α，經(jīng)氨芐青霉素及藍(lán)白班篩選挑取陽(yáng)性菌落增菌后測(cè)序，序列經(jīng)BLAST分析后，每個(gè)部位取5個(gè)HIV-1nef序列，利用Bioe

5、dit、MEGA4等生物學(xué)軟件進(jìn)行基因距離、系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)、同義/非同義替換值(ds/dn)以及氨基酸位點(diǎn)變異等分析。
　　2.根據(jù)序列分析結(jié)果選取CNS和外周來(lái)源的基因變異較大的HIV-1nef陽(yáng)性克隆各一株（共5株），將這5株陽(yáng)性克隆以及本室保存的pcDNA3.1穿梭載體增菌后凝膠回收，并進(jìn)行雙酶切，回收鑒定后以T4連接酶將經(jīng)過(guò)雙酶切的nef和pcDNA3.1連接，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α，經(jīng)氨芐青霉素及藍(lán)白斑篩選出重組pcDNA3

6、.1-nef真核表達(dá)載體，用雙酶切鑒定證實(shí)。然后將重組pcDNA3.1-nef真核表達(dá)載體經(jīng)脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染至U87細(xì)胞中，培養(yǎng)22～62h后經(jīng)免疫組化法及western-blot檢測(cè)Nef表達(dá)情況，并收集上清，ELISA法測(cè)定U87細(xì)胞上清中TNF-α、IL-1β的含量，SPSS軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。
　　結(jié)果：
　　1.成功克隆了一例ADC病人CNS和外周共5個(gè)部位來(lái)源的25株HIV-1nef基因，經(jīng)測(cè)序BLAST分析證

7、實(shí)均為HIV-1nef基因序列，并證明了該ADC患者感染的是HIV-1B亞型。與標(biāo)準(zhǔn)序列HXB2比較，通過(guò)系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)發(fā)現(xiàn)，CNS和外周的nef基因序列位于進(jìn)化樹(shù)中不同的進(jìn)化枝上，表明該ADC患者體內(nèi)nef基因序列在CNS和外周中存在的核苷酸變異不同，而CNS不同部位的nef基因序列大多位于不同的進(jìn)化枝上，且個(gè)別序列之間存在交叉現(xiàn)象，表明在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中不同部位的nef基因所存在的變異也不盡相同，由此說(shuō)明HIV-1nef存在基因多樣性，且

8、可能在進(jìn)化的過(guò)程中受到區(qū)室化作用影響，并存在遷移現(xiàn)象。而由組間基因距離分析可以看出，相同組織來(lái)源的nef序列基因距離較小，而CNS和外周的nef基因距離差異較大，可見(jiàn)不同的機(jī)體環(huán)境對(duì)基因變異也具有一定選擇作用。
　　2.通過(guò)對(duì)ds/dn值的研究發(fā)現(xiàn)，該ADC病例所有HIV-1nef基因序列的ds/dn=2.3241±1.7529，外周組織的HIV-1nef基因序列的ds/dn=3.1809±1.1119，CNS的HIV-1nef基

9、因序列的ds/dn=1.7924±1.2213，ds/dn均大于1(P＜0.05)。表明CNS和外周的HIV-1nef基因變異均受到負(fù)向選擇壓力，病毒自身變異起主要作用，同時(shí)機(jī)體傾向于清除有害的非同義突變。
　　3.氨基酸位點(diǎn)分析結(jié)果顯示，該ADC病例CNS和外周的Nef氨基酸變異位點(diǎn)及頻率均不同，有些氨基酸位點(diǎn)變異在CNS和外周都有發(fā)生，有些位點(diǎn)變異只發(fā)生在CNS，有些位點(diǎn)變異只發(fā)生在外周。
　　4.成功構(gòu)建HIV-1ne

10、f基因的重組pcDNA3.1-nef真核表達(dá)載體，脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染至U87細(xì)胞中，培養(yǎng)36～48h后免疫組化法檢測(cè)Nef蛋白表達(dá)情況，于細(xì)胞內(nèi)均可見(jiàn)到棕色顆粒沉淀，western-blot亦可檢測(cè)到目的蛋白的表達(dá)，說(shuō)明重組pcDNA3.1-nef真核表達(dá)載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染成功，并在U87細(xì)胞內(nèi)特異性表達(dá)。
　　5.ELISA檢測(cè)細(xì)胞上清中細(xì)胞因子含量，結(jié)果顯示，未轉(zhuǎn)染重組pcDNA3.1-nef真核表達(dá)載體的U87細(xì)胞上清的空白對(duì)照組與僅加

11、入轉(zhuǎn)染試劑及僅加入pcDNA3.1質(zhì)粒的對(duì)照組相比，TNF-α、IL-1β的含量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，說(shuō)明轉(zhuǎn)染試劑及pcDNA3.1質(zhì)粒均對(duì)U87細(xì)胞分泌TNF-α、IL-1β水平?jīng)]有影響;與空白對(duì)照組相比，Nef蛋白實(shí)驗(yàn)組U87細(xì)胞上清中TNF-α、IL-1β的含量均有顯著升高(P＜0.05），說(shuō)明Nef蛋白能誘導(dǎo)并增強(qiáng)U87細(xì)胞分泌TNF-α、IL-1β，但CNS來(lái)源與外周組織來(lái)源的Nef蛋白對(duì)U87細(xì)胞TNF-α及IL

12、-1β的分泌量的影響沒(méi)有明顯的差異(P＞0.05）。
　　結(jié)論：
　　1.ADC患者不同組織部位nef基因變異不同，其變異同時(shí)受到自身變異和環(huán)境選擇雙重作用，其中病毒自身變異起主要作用，同時(shí)機(jī)體傾向于清除有害的非同義突變。
　　2.不同組織部位Nef氨基酸變異不同，對(duì)Nef蛋白產(chǎn)生的影響亦不相同，可能導(dǎo)致Nef蛋白某些功能的改變，影響HIV-1在ADC患者體內(nèi)的復(fù)制、感染、凋亡等，可能與ADC發(fā)病機(jī)制有一定聯(lián)系，需進(jìn)一