ADC及非ADC病人HIV-1tat基因多樣性分析及其對U87細胞分泌TNF-α與IL-1β的影響.pdf

1、目的:
　　 艾滋病癡呆綜合征(ADC)是HIV-1侵犯中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)后引起的一種重要的神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥,其病變程度與大腦中HIV-1的數(shù)量并不總是相關(guān),除病毒載量外ADC的發(fā)生還可能與HIV-1本身的基因突變及生物學(xué)活性的改變有關(guān)。HIV-1是自身高度變異的病毒,侵入CNS后,CNS特有的環(huán)境決定了HIV-1在CNS中的變異不同于外周。HIV-1的反式激活因子Tat可以誘導(dǎo)活化巨噬細胞和神經(jīng)膠質(zhì)細胞分泌各種細胞因子,引起

2、神經(jīng)元細胞的損傷,在ADC的發(fā)病機制中發(fā)揮重要作用。為了探討HIV-1 tat基因在CNS和外周中的多樣性以及這種多樣性與ADC之間的關(guān)系,本論文對一例ADC病人和一例非ADC病人CNS和外周共9個部位來源的45株HIV-1 tat第一外顯子基因序列進行了分析,并研究了tat基因變異導(dǎo)致的Tat氨基酸位點的改變對U87細胞分泌TNF-α、IL-1β的影響,為探討ADC的致病機制、預(yù)防和治療ADC提供依據(jù)。
　　 方法:
　

3、　 1、以一例ADC病人和一例非ADC病人外周(淋巴結(jié)、脾臟)和CNS(腦膜、額葉灰質(zhì)、顳葉、基底核、額葉白質(zhì))各部位基因組DNA為模板,巢式PCR擴增HIV-1 tat第一外顯子及鄰近基因序列,PCR產(chǎn)物連接到pGEM-T克隆載體后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α,經(jīng)氨芐青霉素及藍白斑篩選出陽性菌落,每個部位選取5個HIV-1 tat克隆進行測序,使用BioEdit、MEGA4及HIV核酸序列庫中的SNAP在線軟件,對兩例病人不同部位來源的HI

4、V-1 tat序列分別進行系統(tǒng)發(fā)育樹、基因距離、同義替換/非同義替換比值(ds/dn比值)及氨基酸位點分析。
　　 2、根據(jù)序列分析結(jié)果我們選取兩例病人外周脾臟和中樞基底核部位來源的HIV-1 tat克隆各一株(共4株),PCR擴增出tat第一外顯子基因,與pMD19-T克隆載體連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α,氨芐青霉素及藍白斑篩選出陽性菌落,并用雙酶切鑒定和測序證實。雙酶切回收的tat第一外顯子基因與經(jīng)同樣雙酶切的逆轉(zhuǎn)錄病毒表達載

5、體MSCV-IRES-GFP(MIG)連接,轉(zhuǎn)化后,氨芐青霉素篩選出MIG-tat重組逆轉(zhuǎn)錄病毒表達載體,用雙酶切鑒定證實。然后將MIG-tat重組逆轉(zhuǎn)錄病毒表達載體與pUMVC、pCMV-VSV-G共轉(zhuǎn)染293T細胞,熒光顯微鏡下觀察逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝情況。收獲293T細胞上清液,經(jīng)逐孔稀釋法測定逆轉(zhuǎn)錄病毒感染滴度,然后以相同滴度病毒感染U87細胞,熒光顯微鏡檢測重組逆轉(zhuǎn)錄病毒蛋白表達情況,ELISA法測定U87細胞上清中TNF-α、IL

6、-1β的含量,SPSS軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)處理。
　　 結(jié)果:
　　 1、成功克隆了一例ADC病人和一例非ADC病人外周和CNS共9個部位來源的45株HIV-1 tat基因,經(jīng)測序BLAST分析證實均為HIV-1 tat基因序列。系統(tǒng)進化樹可見,ADC病人不同部位來源的tat基因大多位于各自的進化枝上,少數(shù)存在交叉現(xiàn)象,說明ADC病人來源tat基因變異過程中受到明顯區(qū)室化作用影響;非ADC病人不同部位來源的tat基因交叉

7、在一起,說明非ADC病人來源tat基因變異過程中受區(qū)室化作用影響較小。
　　 2、基因距離分析結(jié)果表明,同為外周或同為CNS來源的tat序列間基因距離較小,而外周和CNS的tat序列間基因距離較大,并且同一例病人外周tat序列總比CNS tat序列變異大一些,由此可見,除病毒自身變異外,CNS和外周不同的機體環(huán)境對基因變異也具有一定的選擇作用。另外,ADC病人外周和CNS tat序列與HXB2 tat標準序列間的基因距離差異有顯

8、著性(p＜0.05),而非ADC病人外周脾臟和中樞基底核來源tat序列與HXB2 tat標準序列間的基因距離沒有明顯差異(p＞0.05),可見,不同病人感染的病毒不同、病變嚴重程度不同及機體的免疫功能不同都會對HIV的基因變異產(chǎn)生影響。
　　 3、HIV在進化過程中受到自身變異和環(huán)境選擇的雙重作用,ds/dn值是估計分子進化機制的重要參數(shù)。ADC病人所有HIV-1 tat基因序列ds/dn=3.6653±2.5555,外周來源H

9、IV-1 tat基因序列ds/dn=3.8976±0.0000,中樞神經(jīng)系統(tǒng)來源HIV-1 tat基因序列ds/dn=1.924l±1.0838:非ADC病人所有HIV-1 tat基因序列ds/dn=4.5448±2.9407,外周來源HIV-1 tat基因序列ds/dn=3.2528±1.7273,中樞神經(jīng)系統(tǒng)來源HIV-1 tat基因序列ds/dn=5.5216±3.5461,以上ds/dn值均大于1,表明兩例病人外周和CNS來源的

10、tat基因變異時均受到負向選擇壓力,病毒自身變異起主要作用,同時機體傾向于清除有害的非同義突變。
　　 4、氨基酸位點分析結(jié)果顯示,ADC及非ADC病人來源Tat的氨基酸位點變異不同,同一病人外周和CNS的氨基酸變異位點及頻率也不相同,有些氨基酸位點變異在CNS和外周都有發(fā)生,有些位點變異只發(fā)生在CNS,有些位點變異只發(fā)生在外周。
　　 5、根據(jù)序列分析結(jié)果,我們選取兩例病人外周脾臟和中樞基底核來源的HIV-1 tat基

11、因克隆各一株,命名為Sa、Ba、Sn、Bn(S代表脾臟、B代表基底核、a代表ADC病人、n代表非ADC病人),并成功構(gòu)建了4個含有HIV-1 tat基因的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒表達載體Sa/MIG、Ba/MIG、Sn/MIG、Bn/MIG,將上述重組逆轉(zhuǎn)錄病毒表達載體與pUMVC、pCMV-VSV-G共轉(zhuǎn)染293T。細胞,成功包裝了重組逆轉(zhuǎn)錄病毒,逐孔稀釋法測定重組逆轉(zhuǎn)錄病毒的感染滴度為5×106～6.33×106 IU/ml。
　　

12、6、相同感染滴度重組逆轉(zhuǎn)錄病毒感染U87細胞后,ELISA檢測細胞上清中細胞因子含量,結(jié)果顯示,逆轉(zhuǎn)錄病毒陰性對照組與U87細胞對照組TNF-α、IL-1β的含量沒有顯著性差異(p＞0.05),說明逆轉(zhuǎn)錄病毒對TNF-α、IL-1β的分泌沒有影響;Tat蛋白實驗組U87細胞分泌TNF-α、IL-1β的含量均高于陰性對照組(p＜0.05),說明Tat蛋白能誘導(dǎo)U87細胞分泌TNF-α、IL-1β;4個。Tat蛋白實驗組中,U87細胞分泌T

13、NF-α的含量無明顯差異(p＞0.05),說明這4個Tat序列氨基酸位點的改變對U87分泌TNF-α的水平無影響;而Sa、Ba、Sn3個Tat蛋白實驗組U87細胞分泌IL-1β的含量均高于Bn Tat蛋白實驗組(p＜0.05),說明Tat氨基酸某些位點的改變能增強U87細胞分泌IL-1β的能力。
　　 結(jié)論:
　　 1、ADC及非ADC病人來源的HIV-1 tat基因均存在多樣性,ADC病人HIV-1tat基因的區(qū)室化效

14、應(yīng)明顯高于非ADC病人,ADC病人外周和CNS來源的tat基因之間的差異比非ADC病人更大,同一病人HIV-1 tat基因變異在外周大于中樞神經(jīng)系統(tǒng)。Dn/ds值顯示,兩例病人體內(nèi)HIV-1自身變異起主要作用,同時機體傾向于清除有害的非同義突變。ADC及非ADC病人tat基因變異引起的Tat氨基酸位點變異不同,同一病人外周和中樞神經(jīng)系統(tǒng)Tat氨基酸變異位點及頻率也不相同。
　　 2、HIV-1 Tat蛋白能誘導(dǎo)人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞U