炎癥因子在前節(jié)內(nèi)眼手術(shù)誘發(fā)血視網(wǎng)膜屏障破壞中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、目的：建立一種實(shí)用的眼前節(jié)內(nèi)眼手術(shù)誘發(fā)血-視網(wǎng)膜屏障破壞的大鼠動(dòng)物模型。 方法：27號針頭從大鼠角鞏緣前透明角膜穿刺入前房，針頭的灌注管連接平衡鹽液。平衡鹽液的壓力在0-12mmHg之間波動(dòng)60次。退出針頭，前房成形。對側(cè)眼不處理。術(shù)后泰利必妥眼液點(diǎn)眼。造模后第1、2、3、5和7d采用眼底照相、眼底血管熒光造影(FFA)、光學(xué)相干斷層掃描(OCT)、白蛋白免疫組織化學(xué)染色和Evans藍(lán)作為示蹤劑定量檢測血-視網(wǎng)膜屏障破壞程度。

2、 結(jié)果：術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)眼底照相視網(wǎng)膜未見明顯異常，F(xiàn)FA示模型組背景熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，視網(wǎng)膜血管管徑增粗(晚期部分可見血管鞘)。OCT檢查發(fā)現(xiàn)，與正常對照組和對側(cè)眼對照組相比，術(shù)后第1d開始模型組中央部視網(wǎng)膜開始增厚(F=20.288，P＜0.001)，第2d達(dá)高峰(F=42.756，P＜0.001)，隨后降低，至第5d與正常對照組和對側(cè)眼對照組相近(d3： F=28.244，P＜0.001.；D5：F=2.945，P=0.070t d

3、7;F=0.699，P=0.506)。白蛋白免疫組織化學(xué)染色顯示正常對照組及對側(cè)眼對照組術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)白蛋白陽性染色均局限在視網(wǎng)膜血管內(nèi)，脈絡(luò)膜彌漫性著色。模型組術(shù)后第1d陽性染色主要在視網(wǎng)膜神經(jīng)層血管周圍。術(shù)后第2d陽性染色擴(kuò)散到視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞層、光感受器層、外核層、外叢狀層、內(nèi)叢狀層和神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層。白蛋白表達(dá)于細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞間質(zhì)，白蛋白可滲漏到光感受器層、外核層和外叢狀層的胞外間隙。白蛋白還可被細(xì)胞吞噬，尤其是RPE細(xì)胞。5d后白蛋

4、白陽性染色減低，主要局限于視網(wǎng)膜血管內(nèi)。術(shù)后第1d模型組視網(wǎng)膜Evans藍(lán)滲漏量明顯增加，與正常對照組及對側(cè)眼對照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=8.227，P=0.002)。視網(wǎng)膜Evans藍(lán)滲漏量在術(shù)后第2d達(dá)高峰(F=33.360，P＜0.001)，隨后降低，至第5d與正常對照組和對側(cè)眼對照組相近(d3： F=41.305，P＜0.001；d5：F=0.091，P=0.913；d7： F=0.389，P=0.681)。視網(wǎng)膜熒光素滲漏

5、、視網(wǎng)膜厚度增加、視網(wǎng)膜白蛋白強(qiáng)陽性染色以及視網(wǎng)膜Evans藍(lán)滲漏量增加均證明血-視網(wǎng)膜屏障破壞。 結(jié)論：本研究建立了一種實(shí)用的眼前節(jié)內(nèi)眼手術(shù)誘發(fā)血-視網(wǎng)膜屏障破壞大鼠動(dòng)物模型。 第二部分炎癥因子在眼前節(jié)內(nèi)眼手術(shù)誘發(fā)血-視網(wǎng)膜屏障破壞中的作用 目的：研究炎癥因子[前列腺素E1(PGE1)、前列腺素E2(PGE2)、前列腺素F2α(PGF2α)、白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)]在眼前

6、節(jié)內(nèi)眼手術(shù)誘發(fā)BRB破壞中的作用。 方法：1、大鼠動(dòng)物模型房水和玻璃體中炎癥因子濃度的檢測：實(shí)驗(yàn)分對照組和模型組。大鼠造模后4h、1d、2d、3d、5d和7d采用酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)(Elisa技術(shù))檢測大鼠動(dòng)物模型房水和玻璃體中PGE1、PGE2、PGF2α、IL-1β和TNF-α的濃度。 2、前房注射炎癥因子對BRB的影響：實(shí)驗(yàn)分空白對照組、陰性對照組和炎癥因子組?？瞻讓φ战M大鼠未進(jìn)行任何操作；陰性對照組用微量注射器大鼠

7、前房穿刺注入10uL生理鹽液；炎癥因子組根據(jù)Elisa檢測大鼠動(dòng)物模型房水中PGE1、PGE2、PGF2α、IL-1β和TNF-α的濃度，大鼠前房分別注射PGE1、PGE2、PGF2α、IL-1β和TNF-α。注射后4h和48h后采用Elisa技術(shù)檢測大鼠動(dòng)物模型房水和玻璃體中PGE1、PGE2、PGF2α、IL-1β和TNF-α的濃度；采用Evans藍(lán)作為示蹤劑定量檢測BRB的破壞程度。 3、炎癥因子拮抗劑抵抗炎癥因子誘發(fā)的B

8、RB破壞：PGE1、PGE2和PGF2α實(shí)驗(yàn)分為陰性對照組、模型組、NSAIDs預(yù)防治療組、NSAIDs治療組、皮質(zhì)類固醇預(yù)防治療組和皮質(zhì)類固醇治療組。每組各時(shí)間點(diǎn)各4只大鼠。陰性對照組大鼠用生理鹽水眼液點(diǎn)眼，tid；模型組制造大鼠動(dòng)物模型，用生理鹽水眼液點(diǎn)眼，tid；NSAIDs預(yù)防治療組制造大鼠動(dòng)物模型，造模前2d開始用普南撲林眼液點(diǎn)眼，tid；NSAIDs治療組制造大鼠動(dòng)物模型，造模后開始用普南撲林眼液點(diǎn)眼，tid；皮質(zhì)類固醇預(yù)防

9、治療組制造大鼠動(dòng)物模型，造模前2d開始用百力特眼液點(diǎn)眼，tid；皮質(zhì)類固醇治療組制造大鼠動(dòng)物模型，造模后開始用百力特眼液點(diǎn)眼，tid。IL-1β和TNF-α實(shí)驗(yàn)分為陰性對照組、模型組和治療組。每組各時(shí)間點(diǎn)各4只大鼠。陰性對照組用微量注射器大鼠前房穿刺注入10uL生理鹽液；模型組制造大鼠動(dòng)物模型，然后用微量注射器向大鼠前房穿刺注入10uL生理鹽液；治療組制造大鼠動(dòng)物模型，然后用微量注射器向大鼠前房穿刺分別注入IL-1β抗體和TNF-α抗體

10、。造模后4h和48h后采用Elisa技術(shù)檢測大鼠動(dòng)物模型房水和玻璃體中PGE1、PGE2、PGF2α、IL-1β和TNF-α的濃度；采用Evans藍(lán)作為示蹤劑定量檢測BRB的破壞程度。 結(jié)論：炎癥因子(PGE1、PGE2、PGF2α、IL-1β和TNF-α)在介導(dǎo)眼前節(jié)內(nèi)眼手術(shù)誘發(fā)BRB破壞中起重要作用。 第三部分炎癥因子對體外培養(yǎng)人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞和視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞屏障功能的影響研究 目的：研究炎癥因子[

11、前列腺素E1(PGE1)、前列腺素E2(PGE2)、前列腺素F2α(PGF2α)、白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)]誘導(dǎo)BRB破壞的分子機(jī)制。 方法：1、體外培養(yǎng)HRPE細(xì)胞和HREC細(xì)胞，細(xì)胞接種于膠原包被的聚四氟乙烯膜Transwell培養(yǎng)板，建立HRPE細(xì)胞屏障和HREC細(xì)胞屏障模型。 2、炎癥因子對體外培養(yǎng)HRPE細(xì)胞和HREC細(xì)胞屏障功能的影響研究：實(shí)驗(yàn)分空白對照組、陰性對照組和炎

12、癥因子組(PGE1組、PGE2組、PGF2α組、IL-1β組和TNF-α組)?？瞻讓φ战M不接種細(xì)胞，以檢測本底值；陰性對照組接種細(xì)胞，培養(yǎng)液中不加入任何炎癥因子：炎癥因子組培養(yǎng)液中分別加入PGE1、PGE2、PGF2α、IL-1β和TNF-α。采用STX-2雙桿電極EVOM電壓電阻儀測量HRPE單層細(xì)胞和HREC單層細(xì)胞的跨膜電阻抗(TER)。采用熒光分光光度法檢測HRPE單層細(xì)胞和HREC單層細(xì)胞屏障FD-70熒光素的通透性系數(shù)。

13、 3、炎癥因子對體外培養(yǎng)HRPE細(xì)胞和HREC細(xì)胞屏障功能影響的分子機(jī)制研究：實(shí)驗(yàn)分陰性對照組和炎癥因子組(PGE1組、PGE2組、PGF2α組、IL-1β組和TNF-α組)。陰性對照組接種細(xì)胞，培養(yǎng)液中不加入任何炎癥因子；炎癥因子組培養(yǎng)液中分別加入PGE1、PGE2、PGF2α、IL-1β和TNF-α。采用免疫熒光標(biāo)記-激光共集焦檢測體外培養(yǎng)HRPE細(xì)胞和HREC細(xì)胞ZO-1、Occludin和Claudin-1表達(dá)；RT-PCR

14、檢測體外培養(yǎng)HRPE細(xì)胞和HREC細(xì)胞ZO-1、Occludin和Claudin-1 mRNA表達(dá)；Westem Blotting檢測體外培養(yǎng)HRPE細(xì)胞和HREC細(xì)胞ZO-1、Occludin和Claudin-1蛋白表達(dá)。 結(jié)果：1、炎癥因子對體外培養(yǎng)HRPE細(xì)胞和HREC細(xì)胞屏障功能的影響研究：正常HRPE單層細(xì)胞屏障的TER為54.05±4.65Ω·cm2，PGE1、PGE2、PGF2α、IL-1β和TNF-α共培養(yǎng)48

15、h后，HRPE單層細(xì)胞屏障的TER下降，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 2、炎癥因子對體外培養(yǎng)HRPE細(xì)胞和HREC細(xì)胞屏障功能影響的機(jī)制：免疫熒光標(biāo)記.激光共集焦顯示HRPE細(xì)胞融合時(shí)呈五邊形或六邊形等形狀；HREC細(xì)胞融合時(shí)呈扁橢圓形或長梭形。 結(jié)論：PGE1、PGE2和PGF2α可在mRNA和蛋白水平輕微降低HRPE細(xì)胞和HREC細(xì)胞的ZO-1、Occludin和Claudin-1表達(dá)，減少了緊密連接的條帶數(shù)量，降低了緊密

16、連接條帶的質(zhì)量，破壞HRPE細(xì)胞和HREC細(xì)胞的緊密連接，誘導(dǎo)BRB破壞。IL-1β可在mRNA和蛋白水平明顯降低HRPE細(xì)胞和HREC細(xì)胞的Occludin表達(dá)，打破Occludin和Claudin-1間的平衡，減少了緊密連接的條帶數(shù)量，破壞HRPE細(xì)胞和HREC細(xì)胞的緊密連接，誘導(dǎo)BRB破壞。TNF-α可在mRNA和蛋白水平明顯降低HRPE細(xì)胞和HREC細(xì)胞的ZO-1、Occludin和Claudin-1表達(dá)，減少了緊密連接的條帶數(shù)