鴉膽子素D對HPV16感染細(xì)胞的作用及其可能機(jī)制.pdf

1、目的：研究鴉膽子素D（bruceine D，BD）對高危型人類乳頭瘤病毒(humanpapillomavirus， HPV)16型感染細(xì)胞人宮頸永生化Ect1/E6E7細(xì)胞系是否具有增殖抑制作用，及其可能機(jī)制，為鴉膽子素D應(yīng)用于癌前病變及癌癥治療領(lǐng)域提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，為臨床綜合治療提供新的思路。
　　 方法：
　　 1.以人宮頸鱗狀上皮永生化細(xì)胞系(Ect1/E6E7)作為HPV16型感染的宮頸癌前病變的體外實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，?，

2、5和10μmol/L鴉膽子素D分別體外作用于細(xì)胞24、48、72h，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變;
　　 2.采用MTT法測定鴉膽子素D對Ect1/E6E7細(xì)胞體外培養(yǎng)增殖活性改變;
　　 3.采用細(xì)胞周期法測定鴉膽子素D對Ect1/E6E7細(xì)胞生長周期的影響;
　　 4.采用Hoechst33258細(xì)胞核熒光染色法觀察鴉膽子素D作用后Ect1/E6E7細(xì)胞凋亡情況;
　　 5.采用Annexin V-

3、FITC/PI雙染色法檢測不同濃度鴉膽子素D作用后Ect1/E6E7細(xì)胞凋亡率的變化;
　　 6.實(shí)時熒光定量PCR檢測Ect1/E6E7及Caski兩種細(xì)胞經(jīng)不同濃度鴉膽子素D作用后HPV16 E6、E7基因mRNA的表達(dá)。
　　 結(jié)果：
　　 1.倒置顯微鏡觀察到不同濃度鴉膽子素D對Ect1/E6E7細(xì)胞作用不同時間后細(xì)胞有形態(tài)學(xué)變化，且隨著時間延長、濃度增加，變化更加明顯;
　　 2.MTT結(jié)果顯示

4、Ect1/E6E7經(jīng)1、5、10、15、30μmol/L鴉膽子素D作用24、48、72h后，具有明顯的抑制體外增殖作用，抑制呈時間和濃度的依賴性，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）;
　　 3.經(jīng)1、5、10μmol/L鴉膽子素D體外作用48小時后，細(xì)胞生長周期停滯于G1期;
　　 4.Hochest33258細(xì)胞核染色法顯示Ect1/E6E7細(xì)胞經(jīng)5μmol/L鴉膽子素D體外作用48小時后，細(xì)胞發(fā)生凋亡，可觀察到凋亡小體

5、產(chǎn)生。
　　 5.流式細(xì)胞儀檢測顯示，各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞經(jīng)鴉膽子素D作用48小時后，細(xì)胞凋亡率分別為(6.25±0.76)％、(20.21±1.32)％、(8.61±1.59)％，與對照組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）;
　　 6.Real-time PCR結(jié)果顯示經(jīng)1、5、10μmol/L鴉膽子素D體外作用48小時后，Caski細(xì)胞內(nèi)HPV16 E6、R7 mRNA表達(dá)水平下降，與對照組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0