細胞生長環(huán)境的改善對真皮乳頭細胞誘導能力的影響及機制探討.pdf

1、毛囊是由上皮部分和真皮部分組成，這兩種成分的細胞的相互作用在毛囊的形成與生長中發(fā)揮著重要的作用。毛囊上皮部分包括外根鞘、內根鞘、毛母質和毛干，這些上皮成分均由位于毛囊隆凸部位的上皮干細胞產生。
　　體內動物模型又包括注射法、小室法和皮瓣法，總的原理是將真皮乳頭細胞和上皮干細胞相混合，再用不同方法移植入裸鼠體內，觀察體內毛囊重建與生長情況，從而模仿了真皮乳頭細胞誘導毛囊再生所需的體內環(huán)境。但無論是注射法、小室法和皮瓣法均有各自的缺陷

2、，使真皮乳頭細胞的誘導能力受到了一定程度的損害并繼而影響毛囊的重建。
　　本研究擬從兩方面進行研究，一是改良將真皮乳頭細胞移植入動物體內的實驗模型，從而為真皮乳頭細胞盡可能提供良好的體內環(huán)境，以促進毛囊的重建與生長;二是改良毛囊體外培養(yǎng)所需的環(huán)境，即培養(yǎng)基，使毛囊內的真皮乳頭細胞的毛發(fā)誘導能力盡可能得到保留。該研究結果對于毛發(fā)體內再生重建和治療各類毛發(fā)生長缺陷性疾病提供了重要的理論和臨床實際意義。
　　目的:
　　1.

3、設計一種更簡便、更有效的動物模型，使移植入動物體內的真皮乳頭細胞的誘導能力得到最大限度的保留，從而促進體內毛囊重建。
　　2.改良毛囊器官培養(yǎng)的外壞境，即培養(yǎng)基，以恢復毛囊真皮乳頭細胞的部分誘導能力，從而使體外培養(yǎng)的毛囊的增殖期延長。
　　方法:
　　1.裸鼠體內毛囊重建模型的改良
　　1.1毛囊上皮組織與毛囊真皮細胞的制備:將出生24小時內的C57BL/6J小鼠處死，用75％酒精浸泡消毒后取其背部全層皮膚，然后

4、用PBS液反復潤洗，去除多余脂肪，放入含1％中性蛋白酶的DMEM消化液中，在4℃下消化過夜。次日將已消化過夜的皮膚取出，用鑷子可輕易分離上皮與真皮組織。將完整的上皮片臨時放入含10％小牛血清的Dulbecco's modifiedEagle's medium(DMEM)培養(yǎng)液(DMEM/10)的培養(yǎng)皿中待用。用顯微剪反復地將真皮組織剪成細小顆粒狀，然后放入0.2％膠原酶中在37℃下消化1小時。消化結束后，加入等量的DMEM/10，然后依

5、次用100微米和40微米的細胞濾網過濾，將所得的細胞懸液在200g下離心5分鐘，再將細胞沉淀塊重新懸浮于1毫升的DMEM/10液體中并計數。最后再次將細胞懸液離心并懸浮于20微升的DMEM/10中，使成泥漿狀。
　　1.2設計改良皮瓣法動物模型:將1.5毫升離心管蓋子取下，修剪成一個約1.5cm2大小的圓形硅膠板。將制備的上皮片角質層覆蓋在硅膠板的光滑面，使真皮面朝上。用微型吸管將泥漿樣的真皮懸液涂抹于上皮片的真皮面。將載有上皮片

6、及真皮細胞的硅膠板放于37℃的CO2孵箱中，蒸發(fā)掉多余的水分。將4-5周大的裸鼠腹腔內注射1％戊巴比妥液麻醉，背部用0.5％聚維酮碘液消毒。在背部近臀部設計一切口線，切開皮膚潛行分離皮下，使行成一個能容納假體的空間，將載有上皮片及真皮細胞的硅膠板移植入已分離的皮下，再將切口縫合。
　　1.3為進行對比，我們同時進行了傳統(tǒng)皮瓣法的實驗模型，在裸鼠背部行三邊切口（約0.8×1cm），掀起整個皮膚層，植入一個載有上皮片及真皮細胞的薄層軟

7、硅膠片（約2.5×1.5cm），上皮片的真皮面同樣朝上，其余步驟同改良皮瓣法。1.4打開皮瓣觀察毛發(fā)生長情況:當背部皮膚明顯隆起并且顏色變黑時，我們設計三邊切口，切開皮膚打開皮瓣，向后翻轉使其暴露在外界環(huán)境中，再拉攏周圍的切口并間斷縫合以閉合創(chuàng)面。
　　1.5移植細胞的追蹤:為評估移植入裸鼠體內的上皮細胞，我們選擇用GFP轉基因的C57BL/6J小鼠的背部上皮細胞片。為追蹤真皮細胞，我們用dilinoleyltetramethyl

8、indocarbocyanine perchlorate(DiⅠ)，一種橙紅色細胞膜熒光染料，來對真皮細胞進行染色，再將其移植入裸鼠體內。GFP上皮片與普通乳鼠真皮細胞混合后移植，DiⅠ染色的真皮細胞與普通乳鼠來源的上皮細胞片混合移植。1.6毛發(fā)生長的評估:毛發(fā)生長的評估分別通過外觀和組織學（HE染色石蠟切片及電鏡檢查）來觀察。
　　2.毛囊器官培養(yǎng)液的改良一溶菌酶在毛囊中的表達及對毛囊體外生長的影響
　　2.1毛囊生長周期

9、中的溶菌酶表達變化:分別將處于增殖期和衰退期的毛囊用4％多聚甲醛固定，然后用石蠟包埋、切片（厚度4μm），抗原還原處理后，分別用溶菌酶一抗(兔來源抗鼠，貨號:SAB1306215，1∶1000; Sigma-Aldrich，St.Louis，MO，USA)和相應第二抗體處理組織切片。然后DAB加蘇木精染色顯色。
　　2.2毛囊體外培養(yǎng):選擇4-5周大的C57BL/6J小鼠，從其觸須墊部位顯微分離出觸須毛囊，從中選擇處于增殖期的毛囊

10、并將其放入24孔細胞培養(yǎng)板中進行培養(yǎng)，培養(yǎng)基包括500μlWilliams E培養(yǎng)液，濃度為2mML-谷氨酰胺，10mg/ml的胰島素，10ng/ml的氫化可的松和經稀釋100倍的青霉素與鏈霉素雙抗液。每次試驗將40根毛囊平均分成4組，分別加入溶菌酶1，5，10μg/ml或者不加溶菌酶。試驗共重復3次。
　　2.3毛囊的毛干增加長度與生長周期的測量:我們使用倒置顯微鏡(IX71;Olympus Optical Co.Ltd，Tok

11、yo，Japan)分別在第0，1和3天拍照，觀察毛囊生長周期的變化。
　　2.4Ki-67 and5-bromo-2'-deoxyuridine(BrdU)雙熒光染色:為了追蹤毛囊內上皮干細胞的增殖情況，我們在毛囊體外培養(yǎng)結束前12小時在培養(yǎng)基中加入10μM的BrdU。培養(yǎng)結束后我們挑選出仍處于增殖期的毛囊，放入4％多聚甲醛中固定24小時，石蠟包埋，切成4μm厚的薄片，經抗原修復后，在4℃下用抗BrdU和Ki-67的混合一抗（兔抗

12、小鼠Ki-67，貨號:AB9260，1∶1000; Millipore，Bedford，MA，USA和大鼠抗小鼠BrdU,貨號:ab6326，1∶100; Abcam，Cambridge，MA，USA)孵育組織切片。接下來用相應熒光二抗處理組織切片。細胞核再用4'，6-diamidino-2-phenylindole(DAPI)復染。
　　2.5毛乳頭細胞培養(yǎng):毛乳頭從C57BL/6J鼠觸須毛囊的毛球部分離獲得，再將毛乳頭放入含4

13、型膠原酶的培養(yǎng)皿中消化3小時，然后放入含100 U/ml青霉素、100 mg/ml鏈霉素和20％小牛血清的DMEM中，在37℃、5％ CO2條件下培養(yǎng)。取出的毛乳頭共培養(yǎng)5天，每3天換一次培養(yǎng)液。當細胞在培養(yǎng)皿中生長接近至融合狀態(tài)時，將其以1∶3的比例進行傳代。獲得的毛乳頭細胞暫放入DMEM/10液中等待下一步使用。
　　2.6蛋白免疫印跡法:將培養(yǎng)2代的毛乳頭細胞用5和10μg/ml的溶菌酶處理24小時，然后用RIPA裂解液提取

14、所有蛋白，然后使用10％SDS-PAGE將蛋白轉移至聚偏氟乙烯膜上，將膜分別用一抗在4℃下孵育過夜。一抗包括:兔抗小鼠LEF1，貨號:ab85052，1∶400; Abcam)，兔抗小鼠堿性磷酸酶(ALP)，貨號:sc-30203，1∶1000; SantaCruz Biotechnology)，和兔抗小鼠β-actin(ab8227，1∶1000;Abcam)。然后將膜用對應的二抗在室溫下孵育1小時。免疫復合物用免疫印跡增強化學發(fā)光試

15、劑盒檢測。實驗重復3次，用Image-Pro Plus6.0軟件(Media Cybernetics，Silver Spring，MD，USA)對條帶光密度值進行分析。
　　3.統(tǒng)計學分析
　　應用SPSS19.0軟件進行統(tǒng)計分析，所有數據用均數±標準誤表示（x±SEM）。對于動物體內實驗，兩組間數據比較采用unpaired t-test。對于毛囊器官培養(yǎng)的數據分析，多組之間的數據比較采用One-Way ANOVA分析，先檢

16、驗方差是否相齊，若方差相齊，兩兩比較用Bonferroni test分析，方差不齊則應用welch分析。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。
　　結果:
　　1.與傳統(tǒng)皮瓣法相比，經過我們改良的皮瓣法操作步驟更為簡化，動物在術中失血更少，術后不僅能產生正常形態(tài)和密度的毛發(fā)，而且能明顯縮短真皮乳頭細胞在體內誘導毛囊重建所需的時間。
　　2.我們發(fā)現(xiàn)溶菌酶主要表達在增殖期毛囊的真皮部位（真皮乳頭和真皮鞘），而在衰退期的表達明