Midkine對人胃癌細胞生長的影響及機制研究.pdf

1、目的： 胃癌是世界上常見的惡性腫瘤之一，尤其在中國、韓國、日本等東亞國家。盡管胃癌的診斷和治療已經(jīng)有了長足的進步，但進展期胃癌的預(yù)后依然很差，5年生存率徘徊在20％～30％左右。在過去的幾年中，已經(jīng)證實胃癌的發(fā)生發(fā)展是多基因改變的結(jié)果。胃癌中特殊基因的表達異常在不同的細胞功能中發(fā)揮重要作用，如細胞粘附、信號傳導(dǎo)、細胞分化、細胞增殖及轉(zhuǎn)移。更好的了解胃癌發(fā)生發(fā)展的分子機制將有利于胃癌的診治及預(yù)防。 許多研究表明生長因子不僅

2、促進組織細胞的增殖，而且能誘導(dǎo)組織細胞的惡性轉(zhuǎn)化，他們在人類腫瘤的發(fā)展中發(fā)揮了重要的角色。中期因子(Midkine，MDK，MK)是肝素結(jié)合生長因子家族的成員。人MK基因定位于11p11.2，由5個外顯子和4個內(nèi)含子組成。其啟動子區(qū)域有視黃酸反應(yīng)元件，因此視黃酸可誘導(dǎo)胚胎瘤細胞系和某些組織MK的表達。成熟的MK是一種分泌性蛋白，它在妊娠中期胎兒組織中分布廣泛，出生后表達水平降低。在正常成人組織中，MK在小腸黏膜高表達，在甲狀腺中度表達，

3、在肺、結(jié)腸、胃、腎及脾組織中微弱表達，而在肝臟完全不表達。 近年來研究發(fā)現(xiàn)，MK高表達于多種人類惡性腫瘤，如乳腺癌、食管癌、胃癌、結(jié)直腸癌、肝癌、卵巢癌、膀胱癌、前列腺癌、惡性膠質(zhì)瘤、神經(jīng)母細胞瘤和Wilm's瘤等。這與其具有多種生物學(xué)功能有關(guān)，它不僅在神經(jīng)發(fā)育過程中起到營養(yǎng)及保護作用，還能通過促有絲分裂、促血管生成、誘導(dǎo)細胞惡性轉(zhuǎn)化、抗凋亡等功能影響腫瘤細胞的增殖、分化及凋亡。 目前，關(guān)于MK與胃癌的關(guān)系研究較少。因此

4、，本研究旨在探討在人胃癌組織中MK的表達情況，并研究其在胃癌發(fā)生、發(fā)展過程中的作用及分子機制。 方法： 一、Midkine在人胃癌組織中的表達 1、利用免疫組化方法檢測MK在胃癌及癌旁組織中的表達。 2、利用實時定量PCR技術(shù)檢測MK在胃癌及其配對癌旁組織中的表達。 二、Midkine影響胃癌細胞的增殖 1、利用實時定量PCR技術(shù)分別檢測SGC7901、BGC823、MGC803、MKN1

5、胃癌細胞系中MK表達。 2、利用分子克隆方法構(gòu)建MK逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，并進行酶切及測序鑒定。 3、利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將MK逆轉(zhuǎn)錄病毒載體及空載體轉(zhuǎn)染人胃癌SGC7901細胞，G418篩選獲得穩(wěn)定克隆后進行鑒定。 4、MK靶向siRNA瞬時干涉人胃癌BGC823細胞內(nèi)源性MK表達。 5、利用MTT法及臺盼蘭拒染法檢測MK高表達對SGC7901細胞增殖的影響。 6、利用MTT法檢測靶向干涉MK后對BGC8

6、23細胞增殖的影響。 7、通過軟瓊脂克隆形成實驗檢測上調(diào)MK對SGC7901細胞克隆形成能力的影響。 8、通過裸鼠成瘤實驗檢測上調(diào)MK對SGC7901細胞體內(nèi)成瘤性的影響。 三、Midkine影響胃癌細胞增殖的機制 1、利用Western blot檢測MK對兩條主要生存通路(PI3K/Akt，ERK1/2)的影響。 2、利用Western blot檢測MK對細胞周期調(diào)節(jié)蛋白(cyclinA，cyc

7、linB1，cyclinD1，Cdk2，Cdk4，Cdk6)的影響。 結(jié)果： 一、Midkine在人胃癌組織中的表達 1、免疫組化結(jié)果顯示：MK在胃癌組織的陽性率為54％，而在癌旁正常組織的陽性率僅為28％(P<0.05)。 2、實時定量PCR結(jié)果顯示：在19對人胃癌組織及其配對癌旁正常組織標本中，有11例標本MK在胃癌組織的表達為癌旁正常組織的2倍以上(57.7％)，而僅有2例標本MK在癌旁正常組織的表

8、達為胃癌組織的2倍以上(10.5％)，(P<0.05)。 二、Midkine影響胃癌細胞的增殖 1、實時定量PCR結(jié)果示：四種胃癌細胞系，按MK mRNA水平由高至低排序為BGC823>MGC802>MKNl>SGC7901。 2、經(jīng)BamHⅠ及EcoRⅠ雙酶切MK逆轉(zhuǎn)錄病毒載體得到大小分別為6Kb及400bp左右片段，初步證實載體結(jié)構(gòu)正確，DNA測序后與GeneBank公布的MK cDNA比對證實MK基因序列正

9、確、完整。 3、經(jīng)G418篩選后獲得兩個MK穩(wěn)定高表達的SGC7901細胞克隆。實時定量PCR及Western Blot檢測結(jié)果示，7號和11號克隆MK mRNA及蛋白表達水平均較空載體對照組高5倍以上，且7號克隆高于11號克隆。 4、實時定量PCR結(jié)果示：10nM及20nM MK siRNA靶向干涉后，BGC823細胞內(nèi)源性MK表達分別降低了46.9％和74.8％。Western Blot檢測結(jié)果與實時定量PCR結(jié)果一

10、致。 5、應(yīng)用MTT法及臺盼蘭拒染法繪制的細胞生長曲線示：從72h開始，7號、11號克隆的增殖速率均高于空載體對照組，且7號克隆高于11號克隆。 6、應(yīng)用MTT法繪制的細胞生長曲線表明，從從48h開始，MK靶向干涉組增殖速率明顯低于無關(guān)序列干涉組，且20nM靶向干涉組低于10nM干涉組。 7、集落形成實驗表明，三周后7號克隆形成集落最多，其次為11號克隆，空載體對照組形成集落最少。 8、裸鼠體內(nèi)成瘤實驗表

11、明，皮下注射三周后無論腫瘤體積還是瘤體重量，7號克隆最大，11號克隆次之，二者均較空載體對照組有顯著統(tǒng)計學(xué)差異。 三、Midkine影響胃癌細胞增殖的機制 1、Western Blot結(jié)果示：MK高表達的7號、11號克隆，Akt及ERK的磷酸化水平明顯上調(diào)；相反，在10nM及20nM MK siRNA靶向干涉組，Akt及ERK的磷酸化水平下降。Akt及ERK蛋白水平均無變化。 2、Western Blot結(jié)果示：

12、MK高表達的7號、11號克隆，細胞周期相關(guān)蛋白(cyclinA，cyclinD1，Cdk2，Cdk4，Cdk6)表達水平明顯上調(diào)；相反，在10nM及20nM MK siRNA靶向干涉組，這些蛋白的表達水平下降。 結(jié)論： 1、胃癌組織中MK表達顯著高于癌旁正常組織。 2、MK能夠在體外和體內(nèi)促進胃癌細胞的增殖。 3、MK通過激活PI3K/Akt及ERK1/2兩條主要生存通路促進胃癌細胞增殖。 4、M