MnSOD基因轉(zhuǎn)染及丹參酮對胃癌細胞生長的影響及其分子機制.pdf

1、第一部分,不同分化胃癌細胞株內(nèi)超氧化物歧化酶的表達及內(nèi)源性活性氧水平.目的:檢測正常胃粘膜及MKN-28、SGC7901、BGC823、HGC-27四種不同分化的胃癌細胞株內(nèi)錳型超氧化物歧化酶(MnSOD)mRNA的表達,評價MnSOD轉(zhuǎn)錄水平與腫瘤細胞分化程度、胞內(nèi)活性氧(ROS)水平及增殖活性的相關(guān)性.方法:利用酶底物催化方法測定四種胃癌細胞株的堿性磷酸酶(ALP)及乳酸脫氫酶(LDH)活力.RT—PCR方法檢測正常胃粘膜組織及MK

2、N-28、SGC7901、BGC823、HGC-27四株高、中、低、未分化胃癌細胞株內(nèi)的MnSOD mRNA的表達.利用2'7'-二氯氫化熒光素二酯(DCFH-DA)熒光染色方法檢測不同分化胃癌細胞株的胞內(nèi)ROS水平.四唑藍(MTT)比色法測定不同分化胃癌細胞株的增殖活性并繪制生長曲線.第二部分,MnSOD基因轉(zhuǎn)染對SGC7901胃癌細胞增殖的影響.目的:觀察改變胞內(nèi)MnSOD基因表達水平對SGC7901胃癌細胞增殖的影響.方法:采用電

3、穿孔方法將反義和正義MnSOD cDNA真核表達載體pHβA-SOD(-)/pH-βA-SOD(+)轉(zhuǎn)染SGC7901胃癌細胞,400mg/LG418篩選穩(wěn)定表達克隆并用RT-PCR及Western雜交法鑒定后擴大培養(yǎng).用pHβA空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染作為對照.放射免疫法檢測正義、反義及空載SGC7901胃癌細胞株內(nèi)的銅鋅超氧化物歧化酶(CuZnSOD,SOD1)蛋白含量.分別用直接細胞計數(shù)法、四唑藍(MTT)比色法、平皿克隆形成率試驗及裸鼠移植瘤

4、模型測定三組細胞在體外、體內(nèi)的增殖活性.第三部分,MnSOD調(diào)控SGC7901胃癌細胞增殖的分子機制.目的:進一步研究MnSOD高、低表達調(diào)控SGC7901胃癌細胞增殖的分子生物學機制.方法:采用DCF—DA熒光染色法檢測MnSOD-7901、MnSOD-AS7901及Vector—7901三組細胞的胞內(nèi)ROS水平;透射電鏡觀察細胞超微結(jié)構(gòu)改變;流式細胞儀(FCM)檢測細胞周期;免疫組化法檢測P53、Bcl-2、Ki67、C-erbB2

5、的蛋白表達.RT—PCR檢測三組細胞的P53mRNA表達.第四部分,丹參酮ⅡA誘導SGC7901胃癌細胞凋亡的研究.目的:觀察抗氧化劑丹參酮ⅡA(TanⅡA)在體外對SGC7901胃癌細胞的作用,并對其分子機制作初步研究.方法:分別采用1.0mg/L、2.0mg/L、4.0mg/L、6.0mg/L、8.0mg/L、10.0mg/L的不同濃度梯度的TanⅡA干預SGC7901胃癌細胞24、48、72小時后,用MTT比色法繪制腫瘤細胞生長曲

6、線.采用1.0mg/L、2.0mg/L、4.0mg/L、6.0mg/L、8.0mg/L、10.0mg/L的不同濃度梯度的TanⅡA干預SGC7901胃癌細胞24小時,或同樣采用10.0mg/L的TanⅡA干預0、12、24、36、48小時,應(yīng)用碘化丙叮(PI)及Annexin V雙重染色法,通過流式細胞儀觀察不同濃度梯度及不同時間梯度干預下的SGC7901細胞凋亡率及壞死亡.用透射電鏡直接觀察細胞凋亡形態(tài)并拍攝照片記錄.用RT—PCR檢