CRF01-AE亞型HIV-1感染的MSM患者病毒特異性CTL應(yīng)答與病毒控制水平關(guān)系的研究.pdf

1、目的：
　　艾滋病是一種嚴(yán)重危害人類(lèi)生命健康的致死性慢性傳染病，雖然至今還沒(méi)有有效的疫苗，但大量研究證實(shí)CD8+T細(xì)胞介導(dǎo)的CTL應(yīng)答在疾病的控制過(guò)程中起了重要作用。急性期CTL應(yīng)答的出現(xiàn)伴隨著病毒載量的明顯下降，并在很大程度上決定著病毒調(diào)定點(diǎn)水平的高低。近年來(lái)，男男同性(men who have sex with men，MSM)傳播方式增長(zhǎng)迅速，同時(shí)基于人群水平的分子流行病學(xué)研究表明，在中國(guó)MSM感染者中CRF01 AE亞型已

2、經(jīng)成為主要流行亞型。雖然關(guān)于歐美及高加索人群中流行的B、C亞型病毒的CTL應(yīng)答已經(jīng)有了廣泛而深入的研究，但不同病毒亞型及不同感染人群CTL應(yīng)答特征及控制疾病的方式不盡相同，中國(guó)男同人群中CRF01 AE亞型CTL應(yīng)答特征及控制疾病的方式尚不清楚，針對(duì)我國(guó)男同人群CTL疫苗的研究仍缺乏基礎(chǔ)資料的支持，因此急需對(duì)這部分人群進(jìn)行急性期CTL應(yīng)答的研究，以明確中國(guó)男同人群中CRF01 AE亞型CTL應(yīng)答特征，同時(shí)探索與疾病控制相關(guān)的因素。

3、>　　我們?cè)谇捌谘芯康幕A(chǔ)上設(shè)計(jì)合成了CRF01_ AE亞型傳播簇特異性的Gag、Pol、Nef區(qū)段的重疊肽段及部分HLA型別限制的最佳表位，對(duì)15例CRF01 AE亞型HIV-1急性感染者進(jìn)行動(dòng)態(tài)CTL應(yīng)答的研究，同時(shí)獲得了動(dòng)態(tài)Gag克隆序列，我們發(fā)現(xiàn)在CRF01 AE亞型的MSM感染者中，針對(duì)Gag區(qū)段表位產(chǎn)生持續(xù)的免疫顯性應(yīng)答可以有效控制病毒，為基于中國(guó)CRF01 AE亞型MSM患者的疫苗設(shè)計(jì)提供了理論基礎(chǔ)。
　　材料和方法

4、：
　　1、研究對(duì)象
　　從2008年開(kāi)始對(duì)遼寧大規(guī)模MSM高危人群隊(duì)列進(jìn)行定期隨訪并進(jìn)行血清學(xué)ELISA篩查實(shí)驗(yàn)和Western Blot確認(rèn)實(shí)驗(yàn)，對(duì)血清學(xué)陰性者進(jìn)行集合核酸檢測(cè)，滿足以下一項(xiàng)或多項(xiàng)者:1）在3個(gè)月內(nèi)HIV抗體開(kāi)始變陽(yáng)性者;2）HIV抗體陰性但HIV RNA陽(yáng)性者;3）HIV抗體弱陽(yáng)性但在兩周之內(nèi)可以重復(fù)并OD值較前次升高者;4）WB抗體檢測(cè)少于4條蛋白條帶者，認(rèn)定為新發(fā)感染者。HIV新發(fā)感染者感染時(shí)間的估

5、計(jì)方法為:患者核酸檢測(cè)陽(yáng)性前14天作為HIV感染時(shí)間，初篩陽(yáng)性患者以此次陽(yáng)性與末次陰性的中間時(shí)間作為HIV感染時(shí)間，有可靠高危性行為史的患者結(jié)合高危行為史判定。本研究共對(duì)15例新發(fā)感染者感染3個(gè)月點(diǎn)和1年點(diǎn)PBMC和血漿樣本進(jìn)行縱向研究。
　　2、肽段合成
　　根據(jù)前期獲得的50余條遼寧新發(fā)CRF01_ AE亞型第二簇的全長(zhǎng)序列，利用BioEdit軟件合成共享氨基酸序列，然后用HIV Database中PeptGen Pep

6、tideGenerator軟件生成長(zhǎng)度為17-18mer，10個(gè)氨基酸overlap的Gag、Pol、Nef的重疊肽段，合成CRF01 AE亞型第二簇肽段（Sigma-Aldrich，美國(guó)）。同時(shí)合成了中國(guó)人群中較為常見(jiàn)的HLA-Ⅰ類(lèi)等位基因A02、A11、A24、B13、B40、B51限制的已發(fā)表的最佳表位，及具有明確保護(hù)性作用的B27限制的KK10表位，所有表位均按照CRF01 AE亞型中序列進(jìn)行合成。
　　3、Elispot

7、肽庫(kù)篩查及單肽確認(rèn)
　　采用14×16的二維矩陣肽庫(kù)對(duì)Gag、Pol、Nef區(qū)段肽段進(jìn)行篩查，肽段反應(yīng)終濃度為5μg/ml，每孔加入0.1million細(xì)胞。陽(yáng)性判斷標(biāo)準(zhǔn)為:大于50 SFC/106PBMC同時(shí)大于3倍陰性對(duì)照平均值。同時(shí)將篩查的肽庫(kù)進(jìn)行拆解，進(jìn)行單肽確認(rèn)實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)操作同上述ELISPOT篩查實(shí)驗(yàn)。反應(yīng)結(jié)果的計(jì)算及陽(yáng)性判斷標(biāo)準(zhǔn)也與篩查實(shí)驗(yàn)相同。
　　4、Elispot最佳表位實(shí)驗(yàn)
　　對(duì)具有HLA-Ⅰ類(lèi)

8、等位基因A02、A11、A24、B13、B27、B40、B51的個(gè)體，將相應(yīng)HLA型別限制的最佳表位進(jìn)行Elispot實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)操作同上述篩查實(shí)驗(yàn)。反應(yīng)結(jié)果的計(jì)算及陽(yáng)性判斷標(biāo)準(zhǔn)也與篩查實(shí)驗(yàn)相同。
　　5、DNA提取
　　外周血DNA的提取，使用1ml EDTA抗凝外周靜脈血，采用QIAamp DNAMini試劑盒，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)標(biāo)準(zhǔn)方法快速提取全基因組DNA200μl。將純化后的DNA置-20℃保存?zhèn)溆谩?br>　　6、H

9、LA等位基因分型檢測(cè)
　　HLA分型采用PCR-SSP方法，采用One Lamda公司的Micro SSPTM試劑盒。
　　7、Gag克隆
　　1) HIV-1基因組RNA提取
　　病毒基因組RNA使用QIAamp Viral RNA Mini Kit(QIAgen，German)按操作說(shuō)明從血漿標(biāo)本提取基因組RNA，-80℃保存?zhèn)溆谩?br>　　2) Nested-PCR Gag基因擴(kuò)增及TA克隆測(cè)序
　

10、　采用Takara One Step RNA PCR Kit(AMV)擴(kuò)增Gag全長(zhǎng)。第一輪外側(cè)引物172A(5'-ATCTCTAGCAGTGGCGCCCGAACAG-3'628-648 nt of HIV-1 HXB2)和 Gag-6(5'-TAATGCTTTTATTTTYTCTTCTGTCAATGGC-3'2651-2621 nt ofHIV-1 HXB2)，第二輪內(nèi)側(cè)Gag-763(5'-TGACTAGCGGAGGCTAGAAGG

11、-3'763-783nt of HIV-1 HXB2)和Gag-5(5'-TTCCYCCTATCATTTTTGGTTTCC-3'2377-2400nt of HIV-1 HXB2)。擴(kuò)增條件:第一輪:50℃，30min;94℃變性5 min;94℃30s，50℃30s，72℃2min3個(gè)循環(huán);94℃30s，55℃30s，72℃2min32個(gè)循環(huán);72℃延伸10min;4℃保溫。第二輪:94℃變性5min;94℃30s，55℃30s，72

12、℃2min30個(gè)循環(huán)72℃延伸10min;4℃保溫。1％瓊脂糖凝膠電泳后，對(duì)比MARKER切下1600bp陽(yáng)性片段，QIAgen膠純化試劑盒按照操作說(shuō)明純化回收目的基因片段。純化產(chǎn)物以40ul去離子水洗脫。將其連接入TOPO載體克隆后獲得每一個(gè)患者的Gag序列，并進(jìn)行測(cè)序分析。
　　8、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　應(yīng)用SPSS17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用應(yīng)用Mann-Whitney U test檢驗(yàn)對(duì)CD4計(jì)數(shù)、病毒載量、setpoin

13、t進(jìn)行分析，P＜0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　結(jié)果：
　　1、15例樣本基本臨床信息
　　本研究共納入15例新發(fā)感染者，均為MSM感染者，且均為CRF01_AE亞型第二簇。在感染1年點(diǎn)時(shí)平均CD4計(jì)數(shù)和病毒載量較3個(gè)月點(diǎn)時(shí)均有所下降，但均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＞0.05)。15例患者中A02、B15、B13、C03等位基因頻率較高。
　　2、3個(gè)月點(diǎn)和1年點(diǎn)CTL應(yīng)答的特征
　　通過(guò)分析15例患者感染3個(gè)月點(diǎn)和

14、1年點(diǎn)不同蛋白的應(yīng)答頻率發(fā)現(xiàn)，各區(qū)段蛋白在3個(gè)月點(diǎn)的應(yīng)答頻率整體低于1年點(diǎn)時(shí)的應(yīng)答頻率，其中P17、P24、RT和Nef區(qū)在3個(gè)月點(diǎn)和1年點(diǎn)應(yīng)答頻率均較高，在3個(gè)月點(diǎn)這4個(gè)區(qū)段應(yīng)答頻率均大于40％，在1年點(diǎn)應(yīng)答頻率均大于65％，而P15、GP/TF、PR和IN區(qū)應(yīng)答頻率相對(duì)較低，在3個(gè)月點(diǎn)及1年點(diǎn)應(yīng)答頻率均小于30％。通過(guò)強(qiáng)度分析發(fā)現(xiàn)，各區(qū)段蛋白在3個(gè)月點(diǎn)的平均應(yīng)答強(qiáng)度同樣整體弱于1年點(diǎn)時(shí)的平均應(yīng)答強(qiáng)度，P24、RT和Nef區(qū)在3個(gè)月點(diǎn)

15、和1年點(diǎn)平均應(yīng)答強(qiáng)度均較強(qiáng)，在3個(gè)月點(diǎn)這3個(gè)蛋白區(qū)段平均應(yīng)答強(qiáng)度均大于600 SFU/106 PBMC，在1年點(diǎn)平均應(yīng)答強(qiáng)度均大于1200 SFU/106 PBMC，而P15、GP/TF、PR和IN區(qū)應(yīng)答強(qiáng)度相對(duì)較弱，在3個(gè)月點(diǎn)和1年點(diǎn)平均應(yīng)答強(qiáng)度均小于200 SFU/106 PBMC。
　　3、不同個(gè)體呈現(xiàn)不同的免疫顯性應(yīng)答模式
　　結(jié)合單肽確認(rèn)信息、最佳表位反應(yīng)信息、Gag克隆序列對(duì)3個(gè)月點(diǎn)和1年點(diǎn)樣本進(jìn)行縱向分析，發(fā)現(xiàn)

16、不同患者呈現(xiàn)不同的免疫顯性應(yīng)答模式。按照不同的免疫顯性應(yīng)答模式，15例患者可以分成2個(gè)組。第一個(gè)組為在3個(gè)月點(diǎn)和1年點(diǎn)均針對(duì)同一區(qū)段表位產(chǎn)生免疫顯性應(yīng)答的患者，其中320009、320669、320016和3250204例患者均呈現(xiàn)持續(xù)的Gag區(qū)段表位的免疫顯性應(yīng)答，這4例患者setpoint均較低(＜3.6 copies/ml)，320353和4401052例患者均呈現(xiàn)持續(xù)的Pol區(qū)表位的免疫顯性應(yīng)答，這2例患者的setpoint分別

17、為4.30 copies/ml和4.61 copies/ml，320088、320018、440020、3209754例患者均呈現(xiàn)持續(xù)的Nef區(qū)段表位的免疫顯性應(yīng)答，這4例患者setpoint較高(＞4.4 copies/ml)，其中320018、440020、3209753例患者setpoint均＞5 copies/ml。第二組為在3個(gè)月點(diǎn)和1年點(diǎn)針對(duì)不同區(qū)段表位呈現(xiàn)免疫顯性應(yīng)答的患者，其中320135和3211372例患者均在3個(gè)月

18、點(diǎn)針對(duì)Gag區(qū)段表位呈現(xiàn)免疫顯性應(yīng)答，在1年點(diǎn)時(shí)Gag區(qū)段表位應(yīng)答強(qiáng)度下降，同時(shí)產(chǎn)生針對(duì)Nef區(qū)段表位免疫顯性應(yīng)答。320842和3004302例患者均在3個(gè)月點(diǎn)針對(duì)Pol區(qū)表位呈現(xiàn)免疫顯性應(yīng)答，而在1年點(diǎn)時(shí)均針對(duì)Gag區(qū)段表位產(chǎn)生免疫顯性應(yīng)答。320019患者在3個(gè)月點(diǎn)針對(duì)Nef區(qū)段表位產(chǎn)生免疫顯性應(yīng)答，在1年點(diǎn)時(shí)針對(duì)Nef區(qū)段表位應(yīng)答強(qiáng)度下降，同時(shí)產(chǎn)生針對(duì)Gag區(qū)段表位免疫顯性應(yīng)答。在這5例患者中，320135患者setpoint為

19、3.75 copies/ml，其余4例患者setpoint在4.29-4.62 copies/ml之間。
　　4、持續(xù)的Gag區(qū)段表位的免疫顯性應(yīng)答可以有效控制病毒
　　通過(guò)對(duì)不同個(gè)體免疫顯性應(yīng)答模式及動(dòng)態(tài)變化分析發(fā)現(xiàn)，有持續(xù)Gag區(qū)段免疫顯性應(yīng)答的個(gè)體其setpoint要顯著低于無(wú)持續(xù)Gag區(qū)段免疫顯性應(yīng)答的個(gè)體(p=0.001)，有持續(xù)Nef區(qū)段免疫顯性應(yīng)答的個(gè)體其setpoint要顯著高于無(wú)持續(xù)nef區(qū)段免疫顯性應(yīng)答的

20、個(gè)體(p=0.018)，而有無(wú)持續(xù)Pol區(qū)段免疫顯性應(yīng)答的個(gè)體其setpoint無(wú)顯著差異(p=0.8)。
　　5、Gag區(qū)段表位免疫顯性應(yīng)答驅(qū)動(dòng)病毒變異
　　通過(guò)分析6例在3個(gè)月點(diǎn)針對(duì)Gag區(qū)段表位產(chǎn)生免疫顯性應(yīng)答的患者其免疫顯性表位序列縱向的變異情況發(fā)現(xiàn)，6例患者在3個(gè)月點(diǎn)均針對(duì)不同的Gag區(qū)段表位產(chǎn)生免疫顯性應(yīng)答，其中僅有320669患者針對(duì)的B27限制的KRWIILGLNK(KK10 Gag263-272)表位在1年

21、點(diǎn)時(shí)仍呈現(xiàn)免疫顯性應(yīng)答，其余5例患者在3個(gè)月點(diǎn)時(shí)呈現(xiàn)免疫顯性應(yīng)答的表位在1年點(diǎn)時(shí)雖仍有應(yīng)答但均不是免疫顯性應(yīng)答。序列分析發(fā)現(xiàn)，僅有320669患者針對(duì)的B27限制的KRWIILGLNK(KK10 Gag263-272)表位和320135患者針對(duì)的B13限制的GQMREPRGSDI(GI11 Gag226-236)表位序列未發(fā)生變異，其余4例患者在1年點(diǎn)時(shí)免疫顯性表位序列均發(fā)生了較大程度的變異(≥50％)。同時(shí)320135患者針對(duì)的B13

22、限制的GQMREPRGSDI(GI11 Gag226-236)表位序列雖未發(fā)生變異，但表位側(cè)區(qū)序列在1年點(diǎn)時(shí)發(fā)生了V210A的變異，提示Gag區(qū)段表位免疫顯性應(yīng)答會(huì)對(duì)病毒造成較強(qiáng)的免疫壓力。
　　結(jié)論：
　　1、在CRF01_AE亞型中Gag、Pol、Nef區(qū)段蛋白在3個(gè)月點(diǎn)的應(yīng)答頻率和應(yīng)答強(qiáng)度整體均低于1年點(diǎn)時(shí)的應(yīng)答頻率和應(yīng)答強(qiáng)度。P24、RT和Nef區(qū)在3個(gè)月點(diǎn)和1年點(diǎn)應(yīng)答頻率和強(qiáng)度均較高。
　　2、CRF01_