甲型流感病毒各亞型假病毒系統(tǒng)的構(gòu)建及H1亞型特異性保守表位的鑒定.pdf

1、甲型流感病毒可引起年度季節(jié)性流感和反復(fù)的流感大流行，嚴重危害人民健康。近年來甲型H1N1流感的流行和人感染H5N1禽流感病毒病例不斷增加，進一步提示加強甲型流感病毒的研究和防控的重要性。血凝素(HA)和神經(jīng)氨酸酶(NA)是甲型流感病毒編碼的表面糖蛋白。根據(jù)HA和NA的抗原性，甲型流感病毒可分為16個HA亞型(H1～H16)和9個NA亞型(N1～N9)。HA和NA的重組和重配產(chǎn)生新的病毒是造成流感大流行的重要原因。理論上16個HA和9個N

2、A亞型可自由組合形成144種亞型流感病毒，多數(shù)亞型流感病毒已在自然界被發(fā)現(xiàn)，但引發(fā)大流行的流感病毒的亞型種類仍無法預(yù)測。因此，加強亞型特異性快速診斷、加強監(jiān)測能力以及時發(fā)現(xiàn)流行的流感亞型的變化是應(yīng)對流感大流行重要基礎(chǔ)。為此，本研究構(gòu)建了涵蓋各亞型流感假病毒系統(tǒng)，為流感病毒中和抗體的快速檢測鑒定以及深入研究HA和NA的功能提供材料和手段;另一方面，通過建立基于表位的甲型流感病毒亞型特異性檢測技術(shù)為發(fā)展新型的流感病毒亞型檢測、監(jiān)測技術(shù)提供基

3、礎(chǔ)和依據(jù)。
　　 一、甲型流感病毒各亞型假病毒系統(tǒng)的構(gòu)建
　　 構(gòu)建了16個HA亞型(H1～H16)的真核表達質(zhì)粒，用相應(yīng)的亞型特異性抗體對HA的表達進行了免疫印跡驗證，結(jié)果表明所有16個亞型HA均獲得表達。對除H5和H7外的14個亞型HA的切割位點進行了改造，將切割位點由單堿性氨基酸突變?yōu)槎鄩A性氨基酸，免疫印跡結(jié)果表明切割位點改造不影響HA的表達，其中H1、H6、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15和H

4、16HA經(jīng)改造后發(fā)生切割，H2、H3、H4和H8HA改造后仍未切割。同時，構(gòu)建了9個亞型NA(N1～N9)的真核表達質(zhì)粒，用亞型特異性抗體(N3～N9)進行免疫印跡檢測驗證了相應(yīng)NA的表達，并用商品化的神經(jīng)氨酸酶檢測試劑盒對細胞裂解液的酶活性進行了檢測，結(jié)果表明9個NA的裂解液中具有很強的神經(jīng)氨酸酶活性，間接證明了9個NA亞型的正確表達。
　　 將16個HA亞型和9個NA亞型組合包裝假病毒，144種假病毒感染293T細胞的結(jié)果根

5、據(jù)HA的切割情況及與不同NA組合的感染能力可分為四組。H5、H6、H7和H94個HA亞型均切割表達且與9個NA形成的假病毒均能感染細胞；H1、H10～H168個HA亞型能切割表達但只有與部分NA形成的假病毒具有感染性；H2和H8兩個HA亞型不切割但與部分NA形成的假病毒具有感染性；H3和H4兩個HA亞型不切割且與所有NA形成的假病毒都不能感染細胞。這些結(jié)果提示不同亞型HA在切割性和假病毒感染性上存在很大差異，HA和NA在假病毒水平上存在

6、相互作用的可能，其具體機制還需要進一步的研究。胰酶處理增強了原先不能感染的H3和H4假病毒的感染性。我們對于構(gòu)建的假病毒通過以下三種方法進行了驗證，電鏡下能觀察到完整的病毒粒子形態(tài)，免疫印跡結(jié)果表明HA均摻入相應(yīng)的假病毒，血凝試驗表明摻入假病毒的HA具有生物學(xué)活性。最后，用H1、H3、H5和H7假病毒與相應(yīng)抗體進行了假病毒中和試驗，結(jié)果表明H1、H3、H5、H7假病毒可被相應(yīng)抗體中和，初步說明我們所構(gòu)建的假病毒可用于中和抗體的檢測和評價

7、。
　　 二、甲型流感病毒H1亞型特異性保守表位的鑒定和應(yīng)用
　　 用H1N1甲型流感(H1N1pdm)病毒HA蛋白胞外區(qū)的合成肽庫和H1N1甲流病人恢復(fù)期血清進行肽掃描分析，成功鑒定了五條免疫優(yōu)勢肽，分別是P3(38-52aa)、P5(58-72aa)、P15(158-172aa)、P16(168-182aa)和P31(318-332aa)。除P15外，其余四條合成肽偶聯(lián)物在小鼠中誘導(dǎo)出較強的抗體滴度，免疫印跡和ELI

8、SA試驗表明P3、P5和P31三條肽含有H1N1pdm病毒的優(yōu)勢表位。進一步的免疫印跡分析表明P5和P31只與H1亞型HA蛋白反應(yīng)，且與多個不同年代來源的H1亞型HA均反應(yīng)，，說明P5和P31為H1亞型保守的特異性表位。氨基酸序列比對分析和Insilico保守性分析表明P5表位在H1亞型HA中高度保守，但在H2～H16HA中幾乎不存在。P5表位是一個從未被報道的線性表位，它位于傳統(tǒng)的五個抗原位點區(qū)之外。以此表位作為抗原建立的合成肽ELI

9、SA方法與傳統(tǒng)的血凝抑制試驗相比具有很高的相關(guān)性(X2=58.01，P＜0.01)。兩種方法的一致性為87％，以血凝抑制試驗作為標準方法，合成肽ELISA的靈敏度和特異性分別為96.5%和74.4%。
　　 綜上所述，本研究首次建立了可涵蓋甲型流感病毒已知的16個HA亞型及9個NA亞型的假病毒系統(tǒng)，并在假病毒水平上提示了HA和NA存在相互作用的可能；利用合成肽掃描技術(shù)首次發(fā)現(xiàn)一個H1亞型特異且高度保守的線性表位，利用該表位建立了