貂源H9亞型流感病毒的分離鑒定與血清學(xué)調(diào)查.pdf

1、流感病毒的宿主非常廣泛其中高致病性禽流感病毒可跨越禽類感染其它哺乳動(dòng)物的事件也不斷有內(nèi)部和公開報(bào)道，已報(bào)道的有貓、虎、獅、美洲豹、石貂、犬、雪貂等哺乳動(dòng)物感染。目前，除我國(guó)外有多個(gè)國(guó)家和地區(qū)相繼有水貂感染各種亞型流感病毒的情況的報(bào)道，例如H3N8、H5N1、H5N3、H7N3、H7N7、H8N4、H11N4等。隨著我國(guó)水貂養(yǎng)殖業(yè)的不斷發(fā)展，近幾年出現(xiàn)臨床特征主要為咳嗽、體溫升高、呼吸困難、流鼻液的疑似流感病毒感染的癥狀。針對(duì)這一現(xiàn)象20

2、13年3月本實(shí)驗(yàn)室對(duì)部分水貂的血清進(jìn)行血清學(xué)檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)其血清中的流感病毒抗體水平較高，但是對(duì)該病毒的致病機(jī)制和傳播機(jī)制尚不清楚。雖然而水貂感染流感病毒的研究和報(bào)道少之又少。
　　但是水貂到底能否感染流感病毒和能否在水貂中傳播流感病毒，其主要感染的流感病毒亞型、流感病毒對(duì)水貂的致病性及其遺傳演化分析、貂源流感病毒有哪些分子生物學(xué)特征等等目前都沒有相關(guān)報(bào)道證實(shí)。針對(duì)這一現(xiàn)象本研究主要通過(guò)43份疑似病例利用雞胚接種方法分離出2株新型貂源

3、流感病毒并通過(guò)RT-PCR基因片段擴(kuò)增試驗(yàn)方法確定為H9亞型流感病毒。并對(duì)山東地區(qū)的水貂進(jìn)行隨機(jī)抽樣后與分離的新型貂源H9亞型AIV進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查。主要研究?jī)?nèi)容如下:
　　1、本研究通過(guò)雞胚接種方法進(jìn)行病毒的分離，主要方法是從43份水貂肺組織疑似病料中通過(guò)研磨肺組織后取上清液接種于9-11日齡的SPF雞胚培養(yǎng)3日后發(fā)現(xiàn)部分雞胚有頭部或全身出血現(xiàn)象，收取有血凝效價(jià)的尿囊液后于-20℃保存提純后，結(jié)果獲得2株流感病毒病毒，分別命名為

4、A/mink/Shandong/F6/2013、A/mink/Shandong/F10/2013。
　　2、本研究通過(guò)RT-PCR方法對(duì)兩株分離株的HA基因進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)測(cè)序后進(jìn)行Blast。結(jié)果表明這兩株HA片段的基因序列所與甲型禽流感病毒H9亞型(A/chicken/Henan/HF/2012、A/chicken/Rizhao/853/2013)同源性最高，并具有一系列H9 AIV特征性遺傳位點(diǎn)。
　　3、分離株H

5、A基因片段的核酸序列分析結(jié)果所示經(jīng)過(guò)HA基因片段核酸序列的分析發(fā)現(xiàn)這兩株病毒的的HA基因序列相同，為同一病毒?；蛐蛄蟹治霰砻鰽/mink/Shandong/F6/2013和A/mink/Shandong/F10/2013的HA基因片段與GenBank中收錄的H9亞型AIV參考毒株的HA基因片段同源性在96.3％～97.9％之間。其中兩株分離株的同源性為100％，與A/chicken/zhejiang/FSQ/2011和A/chicke

6、n/zhejiang/329/2011同源性最高為97.9％。
　　4、通過(guò)氨基酸序列分析結(jié)果表明分離株HA基因編碼561個(gè)氨基酸，與A/ehicken/zhejiang/329/2011氨基酸序列同源性達(dá)到98.7％;蛋白裂解位點(diǎn)為PQ↓VPSRSSR，從分子水平推論，屬于非高致病性毒株;分離株HA蛋白受體結(jié)合位點(diǎn)沒有發(fā)生較大變異。
　　5、系統(tǒng)發(fā)生分析表明:新型貂源H9N2亞型流感病毒為禽流感病毒重組病毒，在經(jīng)過(guò)了多年的

7、進(jìn)化發(fā)展之后部分基因發(fā)生了突變從而獲得了可以感染水貂能力。分離株A/mink/Shandong/F6/2013和A/mink/Shandong/F10/2013系同一起源，分離株HA基因與A/chicken/Shanghai/20/2013和A/chicken/zhejiang/329/2011親緣關(guān)系最近。
　　6、本研究通過(guò)血清學(xué)方法進(jìn)行貂源禽流感病毒的流行病學(xué)調(diào)查，旨在確定水貂中是否存在感染新型貂源AIV的感染現(xiàn)象。本次研究

8、中我們通過(guò)采集175份水貂血清對(duì)其進(jìn)行新型貂源H9亞型AIV的血凝抑制實(shí)驗(yàn)檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)血清中發(fā)生血凝抑制反應(yīng)有70份，占40％。初步說(shuō)明山東地區(qū)部分水貂存在感染新型貂源H9亞型AIV現(xiàn)象。
　　本研究為流感病毒H9亞型在水貂種內(nèi)的傳播及流行提供科學(xué)數(shù)據(jù)和理論依據(jù)，對(duì)初步了解山東地區(qū)水貂養(yǎng)殖生產(chǎn)中對(duì)于流感病毒的感染類型和感染率提供具體地?cái)?shù)據(jù)。從而在水貂的日常飼養(yǎng)管理中對(duì)于流感病毒的流行能夠做好針對(duì)性的預(yù)防工作，如水貂源流感病毒疫苗