青藏高原水環(huán)境中H5N1亞型流感病毒的分離鑒定及其遺傳演化分析.pdf

1、2005年5—7月,我國青海湖及周邊區(qū)域首次出現(xiàn)大量候鳥死于H5N1型高致病性禽流感。由于部分候鳥具有在水環(huán)境中生活的習(xí)性,所以水體成為禽流感病毒重要的高危載體。為了了解青藏高原禽流感發(fā)生及傳播模式,本研究建立了一種硝酸纖維素膜過濾的方法檢測水環(huán)境中的禽流感病毒,應(yīng)用此方法從青海湖周邊水環(huán)境樣品中分離出一株高致病性H5N1亞型流感病毒,并對其致病性、生物學(xué)特性、遺傳變異等進(jìn)行了研究。從而為揭示流感病毒引起的病理學(xué)變化規(guī)律及其傳播機(jī)制提供

2、科學(xué)依據(jù)。
　　 用硝酸纖維素膜過濾法對自來水和生活污水中的禽流感病毒進(jìn)行濃縮,回收率分別為96.14％和93.44％,二者無顯著差異。實(shí)驗(yàn)中對禽流感病毒做10倍系列稀釋再回收,回收率隨病毒濃度變化不明顯,應(yīng)用本方法均可以有效起到回收病毒的作用。在自來水中,當(dāng)病毒的投放濃度達(dá)96PFU/L以上時(shí),回收率均在78.13％以上。在污水中,當(dāng)投放濃度達(dá)到96PFU/L時(shí),回收率為47.92％,比自來水中的回收率有所下降。本試驗(yàn)比較了甘

3、氨酸緩沖液、牛肉膏溶液、磷酸緩沖液3種最為常用的洗脫液在不同pH條件下(7、9.5、11)的最佳洗脫效果。試驗(yàn)結(jié)果表明,當(dāng)pH9.5,0.1mol/L甘氨酸緩沖液作為洗脫液時(shí)的病毒回收率最高。用本方法對青海地區(qū)水樣品進(jìn)行分離濃縮,結(jié)果分離出一株高致病性H5N1流感病毒。
　　 從致病性試驗(yàn)可知,此分離株流感病毒感染鴨只后24h,在鴨的肺、腎、肝、脾、腦和胸肌中可檢測到病毒。感染后36h時(shí)機(jī)體內(nèi)病毒含毒最高；到60h時(shí)機(jī)體含毒量下

4、降,在肝、脾、腎檢測不到病毒的存在,而在肺、腦、胸肌病毒含量仍基本維持峰值,小鼠感染流感病毒后變化趨勢和鴨只感染后的變化趨勢幾乎一致,唯一不同的是在感染后60h在肌肉中檢測不到流感病毒,說明流感病毒具有組織嗜性。
　　 用無特定病原體(SPF)雞胚增殖病毒,提取雞胚尿囊液中的病毒總RNA,設(shè)計(jì)禽流感病毒的8個(gè)基因的引物,通過反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)技術(shù)分別擴(kuò)增分離株的8個(gè)基因片段的全序列cDNA,將其分別克隆在PM

5、D18-T載體上進(jìn)行鑒定和序列測定。結(jié)果表明擴(kuò)增的8個(gè)基因片段均包含H5N1流感病毒相應(yīng)的完整開放閱讀框架。用DNAStar分析軟件對本分離株與11株禽流感病毒的基因組的8個(gè)基因序列進(jìn)行分子遺傳演化分析,結(jié)果表明本分離株的HA基因與歐亞種系分離株Shandong/2003同源性為98.6％,且在同一進(jìn)化分支上；而與北美代表株Ireland/1983同源性為86％,且在相距較遠(yuǎn)的進(jìn)化分支上,此比較結(jié)果表明本分離株起源于歐亞種系。本分離株H