Vero細(xì)胞H5N1流感病毒的培養(yǎng)及其后處理工藝研究.pdf

1、近年來我國發(fā)生了多次禽流感疫情，造成了巨大的社會(huì)恐慌和經(jīng)濟(jì)損失。疫苗接種是目前預(yù)防和控制流感最經(jīng)濟(jì)有效的措施。在我國獲得批準(zhǔn)使用的流感疫苗均以雞胚作為病毒生產(chǎn)基質(zhì)。鑒于雞胚的供應(yīng)需要較長的時(shí)間，不能在短期內(nèi)提供足夠的疫苗以應(yīng)對隨時(shí)可能爆發(fā)的流感大流行。而Vero細(xì)胞能夠利用細(xì)胞工廠和微載體-生物反應(yīng)器系統(tǒng)進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng)，生產(chǎn)過程易于控制及實(shí)現(xiàn)規(guī)模化生產(chǎn)，且培養(yǎng)出的流感病毒較雞胚培養(yǎng)的病毒變異小，用其生產(chǎn)出的流感疫苗與當(dāng)時(shí)流行株匹配程度高

2、。因此，開發(fā)Vero細(xì)胞大流行流感疫苗顯得尤為必要。
　　在國內(nèi)外，細(xì)胞工廠培養(yǎng)技術(shù)已經(jīng)是非常成熟和普遍的體外大量培養(yǎng)細(xì)胞的技術(shù)，如培養(yǎng)KMB-17、2BS、MRC-5等細(xì)胞。其具有便捷靈活安全的操作方式，較少的占用空間，可控性好，既有優(yōu)于轉(zhuǎn)瓶的優(yōu)勢，又沒有類似生物反應(yīng)器的應(yīng)用限制。本文主要考察了Vero細(xì)胞在細(xì)胞工廠中的生長情況以及利用細(xì)胞工廠培養(yǎng)流感病毒條件的優(yōu)化，篩選出了細(xì)胞工廠培養(yǎng)H5N1流感病毒較適培養(yǎng)條件為:胞齡為60

3、～72 h、TPCK-胰酶含量為2μg/ml，MOI為0.1，收毒時(shí)間為接種后72 h，培養(yǎng)溫度為33±0.5℃，維持液pH值約為7.6，病毒滴度達(dá)到1∶256～1∶1024。免疫熒光檢測發(fā)現(xiàn)H5N1亞型流感病毒能夠較好地感染Vero細(xì)胞; H5N1Va流感病毒(A/Anhui/1/2005 va)在Vero細(xì)胞上擴(kuò)增的過程中型別保持不變;基因序列比對結(jié)果證實(shí)H5N1Va兩個(gè)表面抗原基因確實(shí)來源于A/Anhui/1/2005(H5N1)

4、。
　　由于Vero細(xì)胞為傳代細(xì)胞系，生產(chǎn)時(shí)存在一些問題，如殘余宿主蛋白可能引起過敏反應(yīng)以及宿主細(xì)胞DNA有致瘤性風(fēng)險(xiǎn)。疫苗生產(chǎn)時(shí)需要控制Vero細(xì)胞的代次在150代以內(nèi)，并進(jìn)行后處理純化以減少殘余Vero細(xì)胞DNA和蛋白含量。本文對Vero細(xì)胞流感疫苗后處理純化工藝進(jìn)行了摸索，確定使用0.65、0.45、0.22μm濾芯進(jìn)行三級過濾澄清、300 KD超濾膜包濃縮、加Benzonase酶37℃處理病毒濃縮液4h、1000 KD超濾