含有HIV-1 vpr基因的重組腺病毒的制備.pdf_第1頁(yè)
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文檔簡(jiǎn)介

1、該研究首先用PCR的方法從pBSXCYPYVPR-xcTHY(簡(jiǎn)稱V<,pr>質(zhì)粒)中擴(kuò)增出全長(zhǎng)的HIV-1 vpr基因片段,克隆到pGEM-T載體,構(gòu)建出克隆載體pGEM-T/vpr,酶切鑒定并對(duì)其進(jìn)行序列分析后,切下vpr片段后插入到pCI質(zhì)粒中polyA的上游,構(gòu)建出中間載體pCIvpr,酶切鑒定正確后,再切下vpr-polyA插入質(zhì)粒pAF5.1中AFP啟動(dòng)子的下游,用PCR的方法鑒定插入方向正確后,并對(duì)其進(jìn)行序列分析,構(gòu)建成p

2、AFvpr載體.在此基礎(chǔ)上,我們利用在大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行腺病毒骨架與克隆有外源基因的穿梭載體同源重組的新策略,獲得重組腺病毒rvAdAFvpr.這一過程包括三個(gè)依次遞進(jìn)的步驟:(1)從pAFvpr載體切下表達(dá)盒:組織特異性啟動(dòng)子AFP-vpr-poly A,將其亞克隆于腺病毒穿梭載體pShuttle,得到pShuttleAFvpr并進(jìn)行酶切鑒定.(2)重組穿梭載體pShuttleAFvpr線性化,與腺病毒骨架載體pAdEasy-1在大腸

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