熒光材料用于HIV-1病毒基因組成像.pdf

1、熒光材料在生物成像領(lǐng)域已得到廣泛應(yīng)用，選擇合適的熒光材料作為指示信號也就成為了研究中的重點(diǎn)和難點(diǎn)。熒光材料需要滿足熒光強(qiáng)度高，耐漂白，毒性小，體積小等要求。目前，常用的熒光材料主要包括:有機(jī)熒光探針、熒光蛋白、和量子點(diǎn)。本論文圍繞熒光材料應(yīng)用于HIV-1病毒基因組成像展開，取得以下主要進(jìn)展:
　　1)為了研究HIV-1在侵染宿主細(xì)胞早期階段中的解離過程，我們構(gòu)建了三種有侵染能力的雙色熒光病毒(HIVRu-TC，HIVRu-EGFP

2、，HIVTC-EGFP)和一種有侵染能力的三色熒光病毒（HIVRu-TC-ECFP）。結(jié)合這些多色熒光病毒顆粒和單顆粒成像技術(shù)，就可以追蹤并觀測到HIV-1的基質(zhì)蛋白，衣殼蛋白以及基因組RNA在活細(xì)胞內(nèi)的分離的全過程。在HIV-1早期侵染階段，病毒顆粒多步解離過程首次被可視化觀察到，我們采用最直觀的方法解決了一個(gè)一直以來十分具有爭議的問題。
　　2)為了延遲釕的有機(jī)金屬配合物的光漂白問題。我們在病毒顆粒的Vpr蛋白的C端插入了六個(gè)

3、半胱氨酸，經(jīng)過病毒的組裝過程，這六個(gè)半胱氨酸與病毒基因組RNA相結(jié)合，通過自身的還原性來延遲釕的配合物的光漂白。基于這一光漂白的延遲效果，對HIV-1病毒顆粒進(jìn)行單色基因組RNA的熒光標(biāo)記，就可以在不改造病毒衣殼CA蛋白并且不影響病毒侵染能力的情況下，對病毒的脫殼過程進(jìn)行成像。
　　3)為了實(shí)現(xiàn)活細(xì)胞內(nèi)HIV-1前病毒基因組的可視化成像，我們利用量子點(diǎn)(QDs)對TALE和CRISPR體系進(jìn)行熒光標(biāo)記，從而實(shí)現(xiàn)對靶向基因序列的識別