含HIV-1 gag基因的重組腺病毒5型與35型嵌合病毒免疫效果研究.pdf

1、近年來(lái)艾滋病毒，即人類免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus，HIV)在世界范圍內(nèi)迅速傳播，尤其是在非洲，已經(jīng)成為死亡的首要病因。聯(lián)合國(guó)艾滋病規(guī)劃署和世界衛(wèi)生組織2006年11月21日共同發(fā)布的,《2006年世界艾滋病報(bào)告》顯示，2006年全球新增艾滋病病毒感染者430萬(wàn)，使艾滋病病毒感染者總數(shù)達(dá)3,950萬(wàn)，同時(shí)全球又有290萬(wàn)人死于艾滋病。截至2006年10月31日，我國(guó)歷年累計(jì)報(bào)告HIV感染者183

2、,733例，其中艾滋病病人40,667例，死亡12,464例。國(guó)際醫(yī)學(xué)界至今尚無(wú)治愈艾滋病的有效藥物和療法。因而研制針對(duì)我國(guó)HIV流行株的預(yù)防性和治療性疫苗迫在眉睫。 目前研制的預(yù)防性疫苗還不能產(chǎn)生針對(duì)HIV的持久免疫力，本研究的目的是構(gòu)建有效抑制HIV復(fù)制的治療性疫苗，有效后再用于預(yù)防。在經(jīng)過(guò)抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物治療、病人血漿HIV病毒載量下降后，應(yīng)用該疫苗替代或減少化學(xué)藥物的應(yīng)用，從而達(dá)到抑制病毒復(fù)制、減輕病情的作用。

3、本研究首先比較HIV-1 gag基因野生型(wt.gag)與密碼子優(yōu)化型(mod．gag)在體外細(xì)胞水平表達(dá)量，經(jīng)Western Blot證實(shí)mod.gag基因的表達(dá)水平明顯高于wt.gag基因。因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)均采用mod.gag構(gòu)建的重組病毒株。經(jīng)PCR，WesternBlot，間接免疫熒光鑒定了密碼子優(yōu)化過(guò)的HIV-1 gag基因在重組腺病毒(rAd5/F35-mod.gag)的正確插入和體外細(xì)胞水平的表達(dá)；用rAd5/F35-mod

4、.gag以不同的方式單獨(dú)或與DNA，rAAV2/1聯(lián)合免疫BALB/c小鼠，ELISA檢測(cè)小鼠血清中的P24特異性抗體，細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色法檢測(cè)小鼠特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)應(yīng)答。結(jié)果重組腺病毒rAd5/F35-mod.gag中g(shù)ag正確插入并且在體外細(xì)胞水平可以很好的表達(dá)目的基因gag；除PBS對(duì)照組外，在小鼠體內(nèi)rAd5/F35-mod.gag單獨(dú)或與DNA聯(lián)合免疫均可誘導(dǎo)特異性的CTL應(yīng)答和血清IgG抗體反應(yīng)，單獨(dú)免疫rA

5、d5/F35-mod.gag兩次分泌IFN-Y的CD8<'+>T細(xì)胞占總CD8<'+>T細(xì)胞的8.828±1.554％，該組CTL，反應(yīng)的效果優(yōu)于DNA初免，rAd5/F35-mod.gag加強(qiáng)的聯(lián)合免疫組(3.62±2.03％)。單獨(dú)免疫rAd5/F35-mod.gag組抗HIV-1 P24 IgG抗體滴度為1：12800，高于其他各組，反應(yīng)結(jié)果與細(xì)胞免疫反應(yīng)結(jié)果一致。 腺病毒5型(Ad5)在人群中的感染率較高，預(yù)先存在的抗體

6、可能會(huì)降低腺病毒載體攜帶的目的基因在體內(nèi)的表達(dá)水平從而減弱其免疫原性。本研究通過(guò)改變Ad5型的纖突蛋白Fiber構(gòu)建了含有g(shù)ag基因的rAd5/F35-mod.gag載體，期望可以避免Ad5特異性免疫反應(yīng)的抑制作用。首先用Ad5-GFP免疫小鼠來(lái)誘導(dǎo)針對(duì)Ad5的特異性免疫反應(yīng)，再用rAd5/F35-mod.gag和rAd5-mod.gag免疫小鼠，檢測(cè)HIV-1 Gag特異性的細(xì)胞免疫反應(yīng)。Ad5-GFP初次感染4周后，rAd5/F35

7、-mod.gag免疫2次后分泌IFN-Y的CD8<'+>T細(xì)胞占總CD8<'+>T細(xì)胞的1.71±0.05％，低于rAd5/F35-mod.gag單獨(dú)免疫2次的特異性細(xì)胞免疫水平(4.34±3.27％)；而rAd5-mod.gag在預(yù)先存在Ad5特異性免疫反應(yīng)影響下，HIV特異性細(xì)胞免疫水平0.75±0.06％，遠(yuǎn)低于rAd5-mod.gag單獨(dú)免疫2次的細(xì)胞免疫水平(4.70±0.73％)。因此rAd35/F35受到預(yù)先存在Ad5特異