HIV-1耐藥基因型檢測in-house法的一致性分析以及基于重組病毒的表型檢測方法的構建.pdf

1、由于高效抗逆轉錄病毒療法在艾滋病治療中的廣泛使用,艾滋病患者的發(fā)病率和死亡率明顯下降,但是耐藥性的產生成為影響抗病毒治療效果的主要因素。HIV耐藥性檢測包括基因型耐藥檢測和表型耐藥檢測,已應用于臨床治療,用以指導治療方案的選擇。因基因型耐藥檢測方法檢測周期短和價格低而在臨床上較常使用,但對于治療史復雜的患者,則需要將基因型和表型耐藥檢測方法的結果結合起來分析,才可提供互補的信息。
　　在本研究的第一部分,為了評價本實驗室自建的HI

2、V-1耐藥基因型檢測in-house法的可重復性,從耐藥數據庫在2008年至2010年間已進行耐藥檢測的樣品中選取204份重新進行檢測,對兩次的耐藥結果進行一致性分析。研究結果表明,在204份樣品中,兩次檢測結果對整體耐藥發(fā)生的判斷的一致率為98.5％(201/204),對每種抗病毒藥物的耐藥發(fā)生的判斷的一致率為92.2％(188/204),其中有167份(占81.9％)樣品的兩次檢測結果對每種藥物的耐藥程度判斷完全一致。并且,對核苷類

3、逆轉錄酶抑制劑(NRTIs)耐藥的判斷不一致要比蛋白酶抑制劑和非核苷類逆轉錄酶抑制劑(NNRTIs)多。兩次檢測共有159個位點存在不一致的耐藥突變形式,在蛋白酶區(qū)第71位和逆轉錄酶區(qū)第103位出現頻率最高。
　　總之,HIV-1耐藥基因型檢測in-house方法具有可重復性,對群體耐藥發(fā)生的判斷具有良好的一致性,但在個別病例的耐藥判斷上也有不一致的情況。在方法學上尤其是對混合堿基的判讀還需進一步標化。由于混合堿基的判讀會直接影響

4、耐藥突變的確定,所以對檢測人員的培訓是非常重要的環(huán)節(jié),檢測人員需嚴格控制序列的質量,并且在序列拼接和清理過程中,嚴格按照混合堿基的判斷標準進行操作,以確保獲得高質量的序列分析結果。
　　在本研究的第二部分,為了構建一種新型的HIV-1耐藥表型檢測方法以及研究病毒的復制能力,首次將由單基因組擴增方法確定為單模板的第一輪擴增產物在體外通過克隆的方式裝入pNL4-3-BstEII中,轉染293T細胞以收獲重組病毒。以TZM-bl細胞作為

5、指示細胞,評價病毒對逆轉錄酶抑制劑的敏感性。本研究首先對pNL4-3-BstEII進行鑒定,與pNL4-3相比,TCID50雖有下降但也有很強的的感染活性,對AZT、3TC、DDI和NVP的敏感性相似,所以將pNL4-3-BstEII作為所構建的重組病毒的對照病毒。
　　將樣品HENDRC593相應的第一輪擴增產物裝入載體中,成功構建重組質粒25份,轉染293T細胞后,篩選出14株具有較強感染活性的重組病毒。為評價患者體內不同準種

6、的復制能力并觀察L210W和T215Y對病毒適應性的影響,選取具有相同耐藥突變的兩個感染性克隆06HENDRC593_D_15_17和HENDRC593_D_15_4,將HIV-1逆轉錄酶區(qū)第210位氨基酸W回復為野生型L,并選取與06HENDRC593_D_15_17時間點相同的感染性克隆06HENDRC593_D_15_10,將第215位氨基酸Y回復為T。重復實驗中AZT、3TC和DDI對6株重組病毒的IC50倍數改變差異94.4％

7、(17/18)在3倍以內。
　　利用復制動力學方法進行病毒適應性的研究,發(fā)現患者在治療45個月時體內準種06HENDRC593_D_15_17比06HENDRC593_D_15_10具有更好的復制能力。將T215Y這個耐藥突變位點回復為野生型后,對AZT的敏感性明顯增加,并且具有更好的復制動力學。AZT對攜帶L210W的重組病毒IC50倍數改變的中位數比不攜帶的重組病毒要高3.5倍,HENDRC593_D_15_4在RT區(qū)第210

8、位氨基酸W回復突變?yōu)長后復制能力明顯升高,而06HENDRC593_D_15_17在突變后復制能力有所下降。
　　總之,我們初步構建了一種基于重組病毒的表型檢測方法,可以檢測患者對逆轉錄酶抑制劑的表型耐藥情況。而且將單基因組擴增的檢測方法與本方法結合起來發(fā)現,患者體內不同準種的復制能力不同,代表病毒主要耐藥突變形式的準種更具有復制適應性上的優(yōu)勢。對耐藥突變T215Y和L210W的復制動力學的影響的研究結果表明,T215Y會導致病毒