焦磷酸深度測(cè)序檢測(cè)HIV-1劣勢(shì)耐藥株方法的建立及初步應(yīng)用.pdf

1、[目的]:
　　建立焦磷酸測(cè)序檢測(cè)HIV-1耐藥劣勢(shì)株平臺(tái)，利用該方法探究HIV耐藥劣勢(shì)株在中國HIV/AIDS初治且療效不佳患者中的流行數(shù)據(jù)及所起到的作用。
　　[方法]:
　　通過寡核苷酸標(biāo)準(zhǔn)品及人工合成序列對(duì)焦磷酸定量測(cè)序的線性、敏感性及穩(wěn)定性進(jìn)行測(cè)定。對(duì)HIV-1基因組RT區(qū)的若干針對(duì)NRTIs及NNRTIs的重要耐藥突變位點(diǎn)設(shè)計(jì)包括PCR及焦磷酸測(cè)序引物，測(cè)序堿基分配順序等測(cè)序方案。研究對(duì)象以我國“十一五”H

2、IV/AIDS抗病毒治療隊(duì)列一（即初治患者）為基礎(chǔ)，選取其中病毒學(xué)治療失敗患者，取起始治療前血漿及部分病毒載量反彈后的血漿提取HIV-RNA，采用RT-PCR的方法對(duì)RT區(qū)基因進(jìn)行擴(kuò)增，使用焦磷酸測(cè)序方法對(duì)若干重要耐藥位點(diǎn)進(jìn)行定量測(cè)序，比對(duì)患者在基線至病毒載量反彈的臨床數(shù)據(jù)信息(CD4+T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)、HIV病毒載量、依從性及血藥濃度、常規(guī)測(cè)序序列)，進(jìn)而探討焦磷酸測(cè)序進(jìn)行劣勢(shì)耐藥株檢測(cè)對(duì)于HIV/AIDS患者臨床治療決策的意義和價(jià)值。

3、
　　[結(jié)果]:
　　1.通過標(biāo)準(zhǔn)品、人工合成K103N野生及突變型序列成功標(biāo)定本實(shí)驗(yàn)測(cè)序精度及線性，檢測(cè)敏感度最低可達(dá)1‰檢測(cè)線性經(jīng)線性回歸，R2=0.9978。
　　2.設(shè)計(jì)針對(duì)NNRTI類及NRTI類藥物耐藥的8個(gè)位點(diǎn)（包括針對(duì)NNRTI類的K103N、Y181CIV;針對(duì)NRTI類的M184VI、D67N、K70ER、L210W、T215YF、K219QE等）及相關(guān)的PCR引物及測(cè)序引物和核苷酸分配序列。使用含

4、B型和AE型HIV病毒的血漿測(cè)試焦磷酸測(cè)序方案及上述8個(gè)位點(diǎn)，均獲成功。
　　3.對(duì)我國“十一五”HIV/AIDS抗病毒治療隊(duì)列一（即初治患者）患者的所有患者基線血漿標(biāo)本進(jìn)行常規(guī)耐藥檢測(cè)，選擇常規(guī)方法未檢出耐藥，但出現(xiàn)病毒學(xué)失敗的患者40例，對(duì)其基線血漿標(biāo)本進(jìn)行上述8個(gè)位點(diǎn)的焦磷酸測(cè)序。共檢測(cè)出劣勢(shì)耐藥突變19個(gè)，以K103N，Y181C出現(xiàn)頻率最高。
　　4.對(duì)出現(xiàn)病毒載量反彈的20例患者反彈后耐藥突變情況進(jìn)行常規(guī)方法檢測(cè)

5、，其中5例焦磷酸檢測(cè)出的突變位點(diǎn)與反彈后突變位點(diǎn)相符。對(duì)部分患者進(jìn)行多位點(diǎn)、多時(shí)間點(diǎn)標(biāo)本進(jìn)行焦磷酸測(cè)序和常規(guī)測(cè)序，觀察到劣勢(shì)耐藥株在藥物壓力下逐漸成為優(yōu)勢(shì)株、焦磷酸測(cè)序早于常規(guī)測(cè)序發(fā)現(xiàn)劣勢(shì)耐藥株等現(xiàn)象。
　　[結(jié)論]:
　　本研究在國內(nèi)首次建立焦磷酸測(cè)序檢測(cè)HIV-1劣勢(shì)耐藥株的平臺(tái)，針對(duì)HIV-1的B及AE亞型的多個(gè)位點(diǎn)獨(dú)立設(shè)計(jì)、完善測(cè)序方法。從HIV/AIDS初治隊(duì)列中選擇基線常規(guī)測(cè)序無耐藥且病毒學(xué)治療失敗的患者進(jìn)行基線