幽門螺桿菌感染中CD8 T淋巴細(xì)胞的應(yīng)答特征及其趨化作用機(jī)制研究.pdf

1、Barry Marshall于1982年偶然發(fā)現(xiàn)幽門螺桿菌，2005年因此獲得諾貝爾生理與醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。H.pylori可長(zhǎng)期定植于胃粘膜，是胃炎、胃潰瘍的主要致病因子，是胃癌的Ⅰ類致癌因子。我國(guó)H.pylori現(xiàn)癥感染率在50％以上。由于抗生素的廣泛使用，H.pylori容易產(chǎn)生耐藥，不易被清除目前面臨著H.pylori的嚴(yán)峻考驗(yàn)。
　　目前H.pylori感染后的免疫應(yīng)答研究主要集中于CD4T淋巴細(xì)胞，包括Th1、Th2、Treg、

2、Th17等細(xì)胞亞型。雖然關(guān)于CD4T淋巴細(xì)胞免疫功能的報(bào)道較多，但仍然不能詮釋H.pylori感染所致多種胃腸疾病的發(fā)病機(jī)理和抗感染保護(hù)的應(yīng)答機(jī)制。H.pylori是一種革蘭陰性菌，主要位于細(xì)胞外。但已有文獻(xiàn)報(bào)道H.pylori可存在于上皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等細(xì)胞中。在H.pylori感染中，CD8T淋巴細(xì)胞逐漸受到研究者的關(guān)注，有研究發(fā)現(xiàn)CD8T淋巴細(xì)胞在H.pylori感染患者中增加，Agnihotri N等檢測(cè)分析內(nèi)窺鏡取的患者胃組織

3、標(biāo)本，發(fā)現(xiàn)在H.pylori陽(yáng)性患者中CD4+/CD8+細(xì)胞比例降低，CD8T淋巴細(xì)胞數(shù)量增加。JosefA等發(fā)現(xiàn)CD8+T淋巴細(xì)胞可以被負(fù)載H.pylori抗原的B細(xì)胞或樹突狀細(xì)胞有效激活，引起特異性應(yīng)答。這提示:H.pylori感染可引起CD8+T淋巴細(xì)胞的應(yīng)答反應(yīng)。但有關(guān)H.pylori感染CD8T淋巴細(xì)胞的研究報(bào)道甚少，尤其是針對(duì)胃粘膜局部的CD8T淋巴細(xì)胞的免疫學(xué)特征與功能的研究尚處于空白。因此，本課題基于H.pylori感染

4、的小鼠模型，從感染部位入手對(duì)胃粘膜局部CD8T淋巴細(xì)胞的應(yīng)答特點(diǎn)、表型特征以及免疫學(xué)功能等進(jìn)行了深入研究。
　　目的:
　　以H.pylori感染小鼠為動(dòng)物模型，深入探索胃粘膜CD8T淋巴細(xì)胞的表型特征、應(yīng)答規(guī)律及其在H.pylori感染中的免疫學(xué)功能作用，將為深刻剖析H.pylori感染過程中胃粘膜CD8T淋巴細(xì)胞的免疫學(xué)特征與作用提供新的認(rèn)識(shí)，為全面解釋H.pylori感染所致多種胃腸疾病的發(fā)病機(jī)理提供新的線索，有助于揭

5、示CD8T淋巴細(xì)胞在H.pylori感染中的免疫作用與應(yīng)答機(jī)制，為H.pylori感染的免疫預(yù)防與治療提供理論依據(jù)。
　　方法:
　　1、采用小鼠胃粘膜單細(xì)胞懸液制備技術(shù)、細(xì)胞內(nèi)因子染色方法和流式細(xì)胞術(shù)，檢測(cè)分析H.pylori感染和未感染小鼠胃粘膜局部CD4T淋巴細(xì)胞和CD8T淋巴細(xì)胞的相對(duì)比例與絕對(duì)數(shù)量、表型特征分子、趨化因子受體以及主要細(xì)胞因子分泌水平等免疫學(xué)指標(biāo)，以研究H.pylori感染后小鼠胃粘膜CD8T淋巴細(xì)胞

6、的應(yīng)答規(guī)律與表型特征。
　　2、采用胃組織直接免疫熒光染色，激光共聚焦下拍片，檢測(cè)H.pylori感染和未感染小鼠胃粘膜CD8T淋巴細(xì)胞數(shù)量及主要分布，以便更直觀的觀察胃粘膜CD8T淋巴細(xì)胞的數(shù)量和分布特點(diǎn)。
　　3、采用anti-CD3/anti-CD28非特異性刺激小鼠胃粘膜CD8T淋巴細(xì)胞，脾淋巴細(xì)胞體外特異性擴(kuò)增培養(yǎng)技術(shù)及細(xì)胞因子染色方法，檢測(cè)非特異性刺激和特異性刺激下，CD8T淋巴細(xì)胞的細(xì)胞因子水平，以探究H.py

7、lori感染是否可誘導(dǎo)CD8T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生非特異性和特異性應(yīng)答。
　　4、采用CD8基因敲除小鼠模型，通過胃粘膜組織DNA提取技術(shù)，Real-time PCR以及胃粘膜HE染色等方法，檢測(cè)小鼠胃粘膜H.pylori定植量，并進(jìn)行病理評(píng)分，以研究CD8T淋巴細(xì)胞在H.pylori感染中的免疫保護(hù)和炎性損傷作用。
　　5、通過蛋白芯片檢測(cè)技術(shù)，測(cè)定小鼠胃粘膜25種趨化因子的表達(dá)情況，探究H.pylori感染小鼠和未感染小鼠胃粘膜

8、趨化因子表達(dá)差異。
　　6、胃上皮細(xì)胞株(AGS)與H.pylori共培養(yǎng)技術(shù)、ELISA和蛋白芯片分析技術(shù)，檢測(cè)培養(yǎng)上清中趨化因子的分泌水平，以研究在H.pylori刺激下，胃上皮細(xì)胞分泌趨化因子的水平和特征。
　　7、通過Transwell實(shí)驗(yàn)和趨化因子受體阻斷實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)6種表達(dá)增強(qiáng)的趨化因子對(duì)CD8T淋巴細(xì)胞的趨化作用，以分析CD8T淋巴細(xì)胞向胃粘膜募集的趨化機(jī)制。
　　結(jié)果:
　　1、H.pylori感染

9、小鼠胃粘膜CD8T淋巴細(xì)胞的比例（6.99％±1.24％）和絕對(duì)數(shù)34125均明顯增加，顯著高于對(duì)照組小鼠（4.01％±0.85％，14457），(P＜0.01)。此外，感染小鼠胃粘膜中CD8T淋巴細(xì)胞的比例和絕對(duì)數(shù)量也顯著高于CD4T淋巴細(xì)胞(P＜0.01)。
　　2、胃粘膜免疫熒光結(jié)果顯示:H.pylori感染組小鼠胃粘膜CD8T淋巴細(xì)胞數(shù)量顯著高于未感染對(duì)照組，且CD8T淋巴細(xì)胞主要分布于粘膜下層。
　　3、H.pyl

10、ori感染小鼠后不同時(shí)間點(diǎn)（2周、4周、8周）監(jiān)測(cè)結(jié)果顯示:感染2周時(shí)小鼠胃粘膜CD8T淋巴細(xì)胞比例顯著增加，在第4周時(shí)達(dá)到峰值(8.0％±1.37％)，第8周時(shí)出現(xiàn)下降。
　　4、H.pylori感染小鼠胃粘膜CD8T淋巴細(xì)胞經(jīng)CD3/CD28抗體非特異性刺激后，可分泌高水平IFN-r、GraB，顯著高于未感染小鼠(P＜0.05，P＜0.01)，TNF-a、IL-17和Perforin水平與未感染小鼠無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。同時(shí)，感染小鼠

11、脾淋巴細(xì)胞經(jīng)體外特異性擴(kuò)增后，在H.pylori全菌抗原刺激下，CD8T淋巴細(xì)胞可產(chǎn)生高水平IFN-r應(yīng)答，顯著高于未刺激組和未感染小鼠。
　　5、H.pylori感染CD8敲除小鼠試驗(yàn)結(jié)果顯示:敲除小鼠胃粘膜H.pylori定植量顯著高于野生型感染小鼠(P＜0.01)，且敲除小鼠的炎癥評(píng)分也明顯高于野生型感染小鼠(P＜0.01)，上述結(jié)果表明:CD8T淋巴細(xì)胞可能發(fā)揮抗H.pylori定植和抗炎癥損傷的免疫保護(hù)作用。
　　

12、6、胃粘膜CD8T淋巴細(xì)胞的免疫記憶表型檢測(cè)顯示:H.pylori感染小鼠胃粘膜CD8T淋巴細(xì)胞高表達(dá)CD44(99.3％)、CD69(87％)、CD103(89.7％)，低表達(dá)CD62L(2.4％)、CCR7(1.2％)。結(jié)果提示，胃黏膜CD8T淋巴細(xì)胞主要為常駐記憶型T細(xì)胞，即Trm細(xì)胞（CD103+、CCR7-、CD69+）。
　　7、趨化因子受體的流式檢測(cè)結(jié)果顯示:H.pylori感染小鼠后胃粘膜CD8T淋巴細(xì)胞表面的CC

13、R3(P＜0.05)、CCR4(P＜0.05)、CCR5(P＜0.01)和CXCR3(P＜0.01)等趨化因子受體表達(dá)顯著高于未感染小鼠，其中CXCR3表達(dá)水平最高，約60％。
　　8、小鼠胃粘膜組織趨化因子蛋白芯片分析發(fā)現(xiàn)，在待檢的25種趨化因子中，感染組小鼠有6種趨化因子(CXCL11、CCL5、CCL12、CCL22、CXCL2、CXCL13)表達(dá)水平顯著高于未感染組小鼠(P＜0.05)。此外，H.pylori與胃上皮細(xì)胞株

14、(AGS)共培養(yǎng)后，ELISA檢測(cè)上清發(fā)現(xiàn)AGS可分泌趨化因子CXCL11，與對(duì)照組相比具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。
　　9、趨化因子Traswell實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn):CXCL11對(duì)CD8T淋巴細(xì)胞有明顯的趨化作用，趨化指數(shù)達(dá)5，CCL5、CXCL13的趨化作用不是很明顯，趨化指數(shù)在1.5左右，而CCL12、CCL22、CXCL2則幾乎沒有趨化作用。用抗體阻斷CD8T淋巴細(xì)胞表達(dá)的趨化因子受體CXCR3后，CXCL11的趨化作用明

15、顯降低，表明CD8T淋巴細(xì)胞可通過CXCL11-CXCR3途徑進(jìn)行趨化并募集到達(dá)胃粘膜組織。
　　結(jié)論:
　　H.pylori感染小鼠后可引起胃粘膜CD8T淋巴細(xì)胞數(shù)量明顯增加，主要為常駐記憶型T淋巴細(xì)胞(Trm)表型，可分泌細(xì)胞因子IFN-r和GraB進(jìn)行應(yīng)答;CD8T淋巴細(xì)胞可通過CXCL11-CXCR3途徑向胃粘膜組織趨化募集，進(jìn)而在H.pylori感染過程中發(fā)揮抗細(xì)菌定植和炎癥損傷的免疫保護(hù)作用。揭示了胃粘膜CD8T