XBP1s在炎癥誘導(dǎo)腹膜纖維化形成中的作用.pdf

1、【背景】
　　腹膜透析(peritoneal dialysis,PD)是終末期腎病(End Stage Renal Disease,ESRD)患者腎臟替代治療的主要方法之一,這基于腹膜作為半透膜具有超濾和彌散的功能。腹膜長(zhǎng)期暴露于生物不相容的腹膜透析液(peritoneal dialysis fluid,PDF)、反復(fù)發(fā)作的腹膜炎以及腹腔積血,都會(huì)造成腹膜的炎癥和損傷。長(zhǎng)期的腹膜炎癥促使腹膜間皮細(xì)胞表型改變、新血管生成增加、細(xì)胞外

2、基質(zhì)沉積和炎細(xì)胞浸潤(rùn),使腹膜處于高轉(zhuǎn)運(yùn)狀態(tài),最終導(dǎo)致腹膜纖維化。這些改變與小分子溶質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)率以及腹膜功能超濾衰竭密切相關(guān)?；|(zhì)沉積和炎性細(xì)胞因子的分泌被認(rèn)為是引起腹膜結(jié)構(gòu)和功能改變的主要原因之一。腹膜間皮細(xì)胞對(duì)腹膜改變、尤其是炎癥導(dǎo)致的腹膜纖維化的發(fā)生發(fā)展過程起重要作用。以白介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β)、白介素-6(Interleukin-6,IL-6)等炎癥因子、細(xì)胞因子及某些生長(zhǎng)因子表達(dá)增加為特征的復(fù)雜的炎

3、癥反應(yīng)過程是導(dǎo)致腹膜透析患者腹膜纖維化,最終導(dǎo)致腹膜失功的中心環(huán)節(jié)。
　　轉(zhuǎn)錄因子剪接型X盒結(jié)合蛋白1(X-Box Binding Protein1 spliced,XBP1s)是非折疊蛋白反應(yīng)/內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(Unfolded protein response,UPR/endoplasmic reticulum stress,ER stress)的重要通路蛋白之一,通過調(diào)控包括核因子κB(Nucleus Factor-κB,NF-κ

4、B)、絲裂原活化蛋白激酶(Mitogen-Activated Protein Kinase,MAPK)、活性氧簇(Reactive Oxygen Species,ROS)等多條途徑?jīng)Q定著炎癥的發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)歸。已證明,XBP1s可以通過ER stress通路介導(dǎo)c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)相關(guān)的炎癥因子IL-6分泌。也可以直接促發(fā)Toll樣受體(Toll Like Receptor,TL

5、R)介導(dǎo)的炎癥反應(yīng),導(dǎo)致炎癥因子IL-6、IL-8和腫瘤壞死因子α(Tumor Necrosis Factor,TNF-α)的大量分泌。在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和炎癥反應(yīng)中,XBP1s作為關(guān)鍵分子起重要調(diào)節(jié)作用。
　　本研究通過體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)初步驗(yàn)證XBP1s在炎癥誘導(dǎo)的腹膜纖維化形成過程中的重要作用及部分機(jī)制,為炎癥導(dǎo)致腹膜纖維化尋找出了新的決定性分子,可能為未來通過干預(yù)炎癥來防治腹膜透析相關(guān)性腹膜纖維化尋找出藥物或基因治療的靶分子。

6、>　　【目的】
　　1)探討XBP1s與腹膜間皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)的關(guān)系;
　　2)驗(yàn)證XBP1s抑制劑對(duì)CG誘導(dǎo)的腹膜炎大鼠腹膜纖維化的作用。
　　【方法】
　　1)收集和培養(yǎng)接受連續(xù)不臥床腹膜透析(Continuous Ambulatory Peritoneal Dialysis,CAPD)治療的ESRD患者腹膜透析流出液細(xì)胞,Western blotting檢測(cè)細(xì)胞中XBP1s蛋白表達(dá),Real-time PCR

7、檢測(cè)腹膜透析流出液細(xì)胞中XBP1s和IL-1βmRNA表達(dá);
　　2)不同濃度IL-1β刺激人腹膜間皮細(xì)胞(Human Peritoneal Mesothelial Cells,HPMC)24h,Real-time PCR檢測(cè)XBP1s、XBP1t mRNA表達(dá);
　　3)以篩選出的IL-1β濃度刺激HPMC不同時(shí)間,Western blotting和Real-time PCR檢測(cè)XBP1s蛋白及mRNA表達(dá),Real-ti

8、me PCR檢測(cè)IL-1βmRNA表達(dá),ELISA檢測(cè)IL-6表達(dá),Western blotting檢測(cè)Fibronectin的表達(dá)變化;
　　4)XBP1s抑制劑(STF083010)處理IL-1β誘導(dǎo)的HPMC,Western blotting方法檢測(cè)XBP1s的表達(dá),Real-time PCR檢測(cè)IL-1βmRNA的表達(dá),ELISA檢測(cè)IL-6的表達(dá),Western blotting檢測(cè)Fibronectin的表達(dá)變化;

9、r>　　5)XBP1s抑制劑與IL-1β聯(lián)合刺激HPMC后,Western blotting檢測(cè)JNK和P-JNK表達(dá);
　　6)建立急性腹膜炎誘發(fā)大鼠腹膜纖維化的模型,模型組腹腔注射0.05％葡萄糖酸氯己定(Chlorhexidine Gluconate,CG),抑制劑組腹腔注射CG和XBP1s抑制劑,對(duì)照組注射含10%乙醇的生理鹽水,2周后麻醉處死;
　　7)H-E和masson染色觀察各組大鼠壁層腹膜組織結(jié)構(gòu);West

10、ern blotting檢測(cè)XBP1s的表達(dá)變化;免疫組化法檢測(cè)XBP1、F4/80、α-SMA和CD31的表達(dá)變化。
　　【結(jié)果】
　　1)不同透齡的ESRD患者腹膜透析流出液細(xì)胞 XBP1s蛋白表達(dá)存在差異;XBP1s mRNA的相對(duì)表達(dá)量和腹膜透析時(shí)間呈正相關(guān),與IL-1β的表達(dá)呈正相關(guān)。
　　2)不同濃度IL-1β處理HPMC24小時(shí),XBP1s和XBP1t mRNA表達(dá)增加,二者比值增加,2ng/ml濃度時(shí)增

11、高最明顯;2ng/ml濃度IL-1β處理HPMC不同時(shí)間,XBP1s蛋白和mRNA表達(dá)增加,提示XBP1s在IL-1β誘導(dǎo)HPMC的表達(dá)變化存在劑量和時(shí)間依賴性;
　　3)IL-1β處理HPMC不同時(shí)間,IL-1βmRNA和IL-6蛋白表達(dá)增加,Fibronectin表達(dá)增加;
　　4)XBP1s抑制劑降低IL-1β誘導(dǎo)的HPMC中IL-1β mRNA和IL-6蛋白表達(dá),下調(diào)Fibronectin的表達(dá);
　　5)XB

12、P1s抑制劑顯著抑制IL-1β誘導(dǎo)的HPMC中JNK的磷酸化活化,而對(duì)總JNK表達(dá)無明顯影響。
　　6)與對(duì)照組相比,H-E和masson染色發(fā)現(xiàn)模型組腹膜明顯增厚和基質(zhì)積聚,而XBP1s抑制劑部分抑制了大鼠模型的腹膜纖維化程度;
　　7)與對(duì)照組相比,模型組腹膜組織 XBP1s蛋白表達(dá)增加;與模型組比較,抑制劑組XBP1s蛋白表達(dá)下降;免疫組化結(jié)果顯示,模型組XBP1、F4/80、α-SMA及CD31增加。與模型組比較,X