自制肝保護(hù)液經(jīng)門靜脈在體冷灌注對梗阻性黃疸大鼠門靜脈血流阻斷肝損傷的保護(hù)作用和機(jī)制的研究.pdf

1、研究背景： 在臨床上，一些惡性腫瘤如：胰頭癌、膽管癌(Ⅰ型)等，常以黃疸為首發(fā)癥狀，腫瘤常早期侵犯門靜脈，導(dǎo)致較低的根治性切除率。近年來，聯(lián)合門靜脈切除重建的胰十二指腸切除術(shù)得到了較為廣泛的認(rèn)同，極大地提高了這類腫瘤的切除率，但是術(shù)中門靜脈血流急性阻斷(portalveinocclusion，PVO)對合并有梗阻性黃疸(obstructivejaundice，OJ)的肝臟必然造成進(jìn)一步損害。目前，對肝臟缺血再灌注損傷(ische

2、miareperfutioninjury，IRI)的研究較多，但對于合并有OJ的PVO對肝臟引起的IRI的研究還未見報道。因此深入研究OJ情況下，PVO后肝臟病理生理改變的分子機(jī)制以及肝臟耐受PVO的安全時限，對臨床如何把握PVO時限、提高手術(shù)耐受性、安全性、促進(jìn)術(shù)后恢復(fù)具有重要意義。 研究認(rèn)為肝臟的IRI主要以肝細(xì)胞凋亡為特征的損害，為防止肝臟的IRI，原位低溫灌注技術(shù)得到了廣泛的應(yīng)用，大大提高了肝臟耐受缺血的時限。常用的灌注

3、液有乳酸林格氏液、HTK液及UW液等，取得了一定減輕IRI的效果，但以往的原位低溫灌注技術(shù)也有許多不足之處： 1、技術(shù)操作復(fù)雜難度大， 2、易引起嚴(yán)重低血壓、肺水腫、高鉀血癥、酸中毒、DIC(disseminatedintravascularcoagulation)等并發(fā)癥， 3、HTK和UW液不能進(jìn)入體循環(huán)。由此我們白行配制了一種自制肝保護(hù)液(self-madeliversolution，SMLS)以用于合并有

4、OJ且侵犯門靜脈的腫瘤切除術(shù)中，PVO期間進(jìn)行在體經(jīng)門靜脈持續(xù)低溫灌注，觀察其是否具有肝保護(hù)作用并進(jìn)一步探明其可能的機(jī)制。 目的： 本課題擬通過對門靜脈轉(zhuǎn)流下，OJ大鼠PVO期間，用4℃SMLS經(jīng)門靜脈在體持續(xù)灌注肝臟，觀察A20mRNA及蛋白的表達(dá)，以及MAPKs的活化與線粒體凋亡途徑上各相關(guān)蛋白的表達(dá)情況的關(guān)系，以期闡明OJ條件下，PVO肝臟損傷機(jī)制以及SMLS對肝保護(hù)作用及其機(jī)制。 方法與結(jié)果： 1

5、、常溫下OJ大鼠PVO模型的建立及其對肝臟能量代謝的影響：正常大鼠被隨機(jī)分為SO(ShameOperation)組、OJ大鼠再隨機(jī)分為A組(膽道再通組)、B組(膽道再通-PVO30min)、C組(膽道再通-PVO60min)及D組(膽道再通-PVO90min)。結(jié)果：D組術(shù)后一周大鼠累計病死率60％，而SO、A、B及C組病死率為0％。D組ALT、AST、TBIL在術(shù)后各時相點(diǎn)都顯著高于SO、A、B、C組，且在術(shù)后24h仍無下降趨勢(P＜

6、0.05)；通過反應(yīng)肝細(xì)胞線粒體能量代謝的指標(biāo)觀察，D組RCR、P/O、ATP值在術(shù)后各時相點(diǎn)都明顯低于SO、A、B及c組；肝組織HE染色光鏡觀察即顯示，D組肝組織結(jié)構(gòu)嚴(yán)重紊亂，肝細(xì)胞廣泛空泡化及壞死，炎細(xì)胞浸潤，淤膽較重，明顯重于其它各組。 2、SMLS對OJ大鼠PVO肝損傷的保護(hù)：OJ大鼠被隨機(jī)分為E組(膽道再通、門靜脈周圍游離、切除肝尾狀葉，90min后關(guān)腹)、F組(膽道再通、肝尾狀葉分流門靜脈、余肝PVO90min、恢復(fù)

7、正常門靜脈血流、切除肝尾狀葉，關(guān)腹)、G組(F組+門靜脈肝側(cè)灌注4℃乳酸林格氏液)、H組(F組+門靜脈肝側(cè)灌注4℃SMLS)；術(shù)后各組ALT、AST和TBIL水平均呈升高趨勢，均在術(shù)后6h達(dá)高峰，在術(shù)后24h有所下降，其中F、G及H組升高較E組明顯且有顯著性差異(P＜0.05)，而F組及G組又顯著高于H組，F(xiàn)組高于G組之間有顯著性差異(P＜0.05)。未缺血的E組大鼠術(shù)后因膽道再通其內(nèi)毒素(ETX)水平，在術(shù)后各時相點(diǎn)呈逐漸下降趨勢，說

8、明膽道梗阻在本實(shí)驗(yàn)中是ETX增高的主要因素，而膽道再通是有利于消除EFX的重要措施；在受到PVO損傷的F組其ETX在術(shù)后各時相點(diǎn)呈大幅度的逐漸增高，到術(shù)后72h亦無明顯下降趨勢；而在給予門靜脈灌注的G組和H組在術(shù)后雖呈逐漸增高趨勢，但增高的幅度不如F組大，有顯著性差異(P＜0.05)，且G組和H組到術(shù)后24h開始逐漸下降；而給予SMLS的H組其ETX在術(shù)后各時相點(diǎn)均低于給予乳酸林格氏液灌注的G組，有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。肝組織HE

9、染色光鏡觀察，F(xiàn)組病理改變明顯重于其它各組；透射電鏡觀察，F(xiàn)組線粒體損傷亦明顯重于其它各組；TUNEL凋亡檢測，各組術(shù)后0h即有肝細(xì)胞凋亡，但E組在術(shù)后各時相點(diǎn)呈逐漸下降趨勢；相反，F(xiàn)組、G組和H組均呈逐漸升高趨勢，在術(shù)后6h達(dá)到高峰，在術(shù)后24h有所下降，其中F組和G組明顯高于H組并有顯著性差異(P＜0.05)。F組高于G組且有顯著性差異(P＜0.05)。 3、MAPKs信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在SMLs保護(hù)肝細(xì)胞中的作用及機(jī)制：采用逆轉(zhuǎn)

10、錄PCR、Westernblotting及TUNEL等技術(shù)分別檢測A20mRNA及其蛋白、P-JNK、P-ERK、P-p38、bcl-2、Bax、caspase-3等蛋白以及肝細(xì)胞凋亡百分率的檢測，同時給予MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的特異性抑制劑SP600125(JNK特異性抑制劑)、PD98059(ERK特異性抑制劑)和SB203580(P-38特異性抑制劑)在灌注SMLS前30min，經(jīng)尾靜脈注射作為預(yù)處理，再次觀察各組肝細(xì)胞凋亡的變化；

11、結(jié)果顯示，H組A20mRNA，A20、P-ERK及bcl-2蛋白顯著高于E、F及G組(P＜0.05)，其凋亡率卻相反，G組又顯著高于F組(P＜0.05)，而F組P-JNK、Bax、caspase-3蛋白及凋亡率顯著增高，與E、G及H組比有顯著性差異(P＜0.05)，當(dāng)被給予特異性抑制劑后，給予SP600125時肝細(xì)胞凋亡進(jìn)一步減少，而給予PD98059時肝細(xì)胞凋亡增加，給予SB203580時肝細(xì)胞凋亡無明顯變化。 結(jié)論：

12、 1、梗阻性黃疸大鼠門靜脈血流急性阻斷引起肝細(xì)胞線粒體能量代謝障礙； 2、初步判定梗阻性黃疸大鼠在門靜脈轉(zhuǎn)流下，耐受門靜脈血流阻斷的安全時限為60min： 3、肝細(xì)胞凋亡是梗阻性黃疸條件下，門靜脈血流急性阻斷對肝臟造成的缺血再灌注損傷引起肝損害的一種重要方式。線粒體途徑可能介導(dǎo)了肝細(xì)胞的凋亡； 4、經(jīng)門靜脈在體灌注低溫乳酸林格氏液或自制肝保護(hù)液，可以減輕梗阻性黃疸大鼠因門靜脈血流急性阻斷導(dǎo)致的肝細(xì)胞線粒體損傷及肝

13、細(xì)胞凋亡。其中自制肝保護(hù)液的肝保護(hù)作用明顯優(yōu)于乳酸林格氏液； 5、梗阻性黃疸大鼠門靜脈血流急性阻斷激活JNK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，介導(dǎo)線粒體途徑bcl-2/bax蛋白平衡的偏移，活化下游的凋亡執(zhí)行蛋白caspase-3，從而促進(jìn)肝細(xì)胞凋亡： 6、自制肝保護(hù)液經(jīng)門靜脈在體持續(xù)低溫灌注肝臟，可以促進(jìn)A20mRNA及其蛋白的高表達(dá)，由此激活ERK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，抑制JNK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，反向調(diào)節(jié)線粒體途徑bcl-2/bax蛋白平衡的逆轉(zhuǎn)，