吡非尼酮對(duì)心臟成纖維細(xì)胞功能的影響及作用機(jī)制研究.pdf

1、第一部分、吡非尼酮對(duì)心臟成纖維細(xì)胞功能的影響及其作用機(jī)制
　　 心臟成纖維細(xì)胞（cardiacfibroblasts，CFs）是心肌中數(shù)量最多的一類細(xì)胞，約占心臟細(xì)胞總數(shù)的60％～70%。CFs遍布于心肌組織之中，包繞著心肌細(xì)胞并與心肌細(xì)胞外基質(zhì)(extracellularmatrix，ECM)相連接。CFs的生物學(xué)功能極為廣泛，能夠調(diào)控細(xì)胞外基質(zhì)（extracellularmatrix，ECM）代謝、合成分泌多種細(xì)胞因子、介導(dǎo)

2、心肌機(jī)械/電信號(hào)傳導(dǎo)，并參與血管新生調(diào)控等過程，在心臟正常生理機(jī)能的維持及心室重構(gòu)過程中發(fā)揮著重要作用。
　　 心室重構(gòu)是多種心臟疾病的共同結(jié)局，其過程常伴有心肌纖維化(myocardialfibrosis，MF)的發(fā)生。CFs在MF中扮演著重要角色。病理因素刺激下，CFs會(huì)發(fā)生表型轉(zhuǎn)化，活化為心臟肌成纖維細(xì)胞（cadiacmyofibroblasts，CMFs）。CMFs具有更強(qiáng)的增殖能力、更易于發(fā)生遷移、合成ECM及對(duì)ECM

3、代謝具有重要調(diào)節(jié)作用的基質(zhì)金屬蛋白酶(matrixmetalloproteinases，MMPs)增加而參與心室重構(gòu)過程。另外，CMFs還分泌大量的生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子，通過自分泌和旁分泌效應(yīng)，作用于心肌組織中的各種靶細(xì)胞，從而進(jìn)一步推動(dòng)心室重構(gòu)的發(fā)展。盡管在最初，CFs生物學(xué)性狀和功能的諸多改變有益于受損心肌組織的修復(fù)和心功能的維持，其長(zhǎng)期效應(yīng)則導(dǎo)致心肌僵硬度的不斷增高，心臟功能障礙的發(fā)生，并最終導(dǎo)致心力衰竭(heartfailure，

4、HF)。因此，以CFs為靶標(biāo)的抗MF、心功能保護(hù)藥物的開發(fā)已成為目前心血管疾病治療領(lǐng)域極具潛力的方向。
　　 吡非尼酮(Pirfenidone)為新型小分子抗纖維化藥物。在不同種屬動(dòng)物上，采用多種不同建模方法所致MF模型中的研究結(jié)果表明，吡非尼酮能夠顯著減輕MF的程度、改善心功能、逆轉(zhuǎn)心室重構(gòu)進(jìn)程。CFs在MF過程中居于核心地位，在心室重構(gòu)中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。盡管已有為數(shù)較多的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證據(jù)表明吡非尼酮具有抗MF作用，并且CFs可能

5、是其作用的主要靶細(xì)胞，但吡非尼酮是否能夠直接影響CFs的生物學(xué)功能，以及其作用的具體機(jī)制為何，目前尚無研究報(bào)道。因此，本研究的主要目的為探討吡非尼酮對(duì)體外分離培養(yǎng)的CFs的生物學(xué)功能，主要是在心室重構(gòu)過程中具有重要意義的一些功能，包括增殖、表型轉(zhuǎn)化、膠原收縮、細(xì)胞因子分泌等的影響，以及其可能的作用機(jī)制，為將來吡非尼酮應(yīng)用于臨床抗MF治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 本研究的主要結(jié)果如下:
　　 (1)吡非尼酮能夠顯著抑制體外培養(yǎng)

6、的CFs的增殖，降低Ki67陽性細(xì)胞比率，且其效果并非由細(xì)胞毒性所致。吡非尼酮能夠顯著抑制CFs向CMFs的表型轉(zhuǎn)化過程，降低α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)的表達(dá)，另外，吡非尼酮處理后CFs的膠原收縮能力、細(xì)胞遷移能力均顯著減弱。以上結(jié)果表明，吡非尼酮能夠直接影響CFs的生物學(xué)功能，從而發(fā)揮其抗MF，逆轉(zhuǎn)心室重構(gòu)的作用。
　　 (2)吡非尼酮降低了MMP-9的合成和分泌，相反地，升高了TIMP-1的合成和分泌，即吡非尼酮降低了

7、CFs中MMP-9/TIMP-1的比率。MMP-9/TIMP-1比率在心室重構(gòu)過程中上調(diào)，對(duì)于ECM代謝及CFs遷移等具有重要調(diào)節(jié)作用，逆轉(zhuǎn)MMP-9/TIMP-1比率可能是吡非尼酮抗MF的重要分子機(jī)制之一。
　　 (3)吡非尼酮降低了CFs中TGF-β1的合成和分泌，相反地，升高了IL-10的合成和分泌。TGF-β1在MF中具有關(guān)鍵作用，被認(rèn)為是最重要的促纖維化細(xì)胞因子，IL-10則具有抗炎癥、抗纖維化作用，因而吡非尼酮對(duì)CF

8、s合成分泌TGF-β1、IL-10的調(diào)控作用可能是其抗MF機(jī)制的另一個(gè)重要方面。以上結(jié)果表明，吡非尼酮對(duì)CFs的功能具有直接影響，在細(xì)胞水平上，吡非尼酮能夠抑制CFs的增殖、膠原收縮及遷移能力；在分子水平上，吡非尼酮能夠降低α-SMA的表達(dá)，下調(diào)MMP-9/TIMP-1比率，抑制促纖維化細(xì)胞因子TGF-β1的表達(dá)并促進(jìn)抗炎癥、抗纖維化因子IL-10的表達(dá)。
　　 第二部分、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β誘導(dǎo)基因22在心肌梗死組織中的表達(dá)變化、心

9、臟成纖維細(xì)胞中的表達(dá)調(diào)控及功能
　　 近年來，隨著基因組學(xué)及蛋白質(zhì)組學(xué)的發(fā)展，心室重構(gòu)及心肌纖維化(myocardialfibrosis，MF）相關(guān)基因的篩選鑒定工作取得了很大突破。有研究報(bào)道，在多種心臟病、MF模型心肌組織中轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β誘導(dǎo)基因22(TGF-βstimulatedclone-22，TSC-22)表達(dá)上調(diào)，并推測(cè)其可能參與了MF過程的調(diào)控。與這些報(bào)道相一致，前期工作中我們也發(fā)現(xiàn)了TSC-22在有明顯MF表現(xiàn)的心

10、力衰竭(heartfailure，HF)病人心肌組織中表達(dá)上調(diào)，但TSC-22在心肌損傷后的表達(dá)變化規(guī)律，以及其在MF的關(guān)鍵細(xì)胞——CFs中的表達(dá)調(diào)控因素及發(fā)揮的生物學(xué)功能尚不清楚。因此，本研究旨在探討TSC-22蛋白水平的表達(dá)在心肌梗死(myocardialinfarction，MI)后到HF發(fā)生過程中的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律、誘導(dǎo)其在CFs中表達(dá)的因素和機(jī)制，以及其在CFs中發(fā)揮的生物學(xué)功能，為心室重構(gòu)及MF治療提供新靶標(biāo)。
　　 動(dòng)

11、物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:大鼠MI后TSC-22蛋白在心肌組織中的表達(dá)呈動(dòng)態(tài)變化，其表達(dá)在MI后1天、7天時(shí)上調(diào)，而在4周時(shí)下降。體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，TGF-β1通過TGF-β1Ⅰ型受體，誘導(dǎo)TSC-22在CFs中的表達(dá)，且促使其亞細(xì)胞定位發(fā)生變化，主要在細(xì)胞核中表達(dá);另外，接觸抑制情況下，TSC-22在CFs中的表達(dá)也顯著升高。另外，在CFs中轉(zhuǎn)染TSC-22特異小干擾RNA(smallinterferingRNA，siRNA)，敲低TSC-22

12、表達(dá)后，TGF-β1誘導(dǎo)下CFs中α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-smoothmuscleactin，α-SMA)的表達(dá)顯著下降，這一結(jié)果提示TSC-22介導(dǎo)了TGF-β1誘導(dǎo)下的CFs向心臟肌成纖維細(xì)胞（cadiacmyofibroblasts，CMFs）表型轉(zhuǎn)化的過程，在其中為正性調(diào)節(jié)因子。
　　 以上結(jié)果表明，TSC-22蛋白在MI后呈動(dòng)態(tài)變化規(guī)律，在急性MI期表達(dá)上調(diào)，而當(dāng)發(fā)生HF時(shí)下降。在MI后不同時(shí)相中TSC-22表達(dá)水平的