農(nóng)桿菌介導(dǎo)玫瑰茄遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立及擬南芥AtPSK3基因的克隆.pdf

1、花青素因?yàn)槠渚哂锌咕?、抗炎、抗過敏、抗氧化和抗腫瘤效果引起了世界各國科學(xué)家的廣泛關(guān)注。由于資源和環(huán)保問題，各國開始了用植物細(xì)胞培養(yǎng)物生產(chǎn)花青素的研究。多年來的研究表明，生產(chǎn)周期長(約15天)已經(jīng)成為制約這一成果走向產(chǎn)業(yè)化的瓶頸之一。植物基因工程技術(shù)的日臻完善與植物肽類生長因子(Phytosulfokine，PSK)及其基因的發(fā)現(xiàn)為解決上述難題提供了一條嶄新的途徑。農(nóng)桿菌法是最常用的一種植物遺傳轉(zhuǎn)化方法，迄今獲得的許多雙子葉植物的轉(zhuǎn)基因植

2、株都是通過這一轉(zhuǎn)化途徑實(shí)現(xiàn)的。植物硫肽激素-α(PSK-α)是第一種受到鑒定的植物肽類生長因子，它是一個(gè)硫酸酯化的五肽分子，能促進(jìn)植物培養(yǎng)細(xì)胞，特別是低密度培養(yǎng)的植物細(xì)胞快速增殖；研究發(fā)現(xiàn)擬南芥中有4個(gè)PSK基因。 該文首次對農(nóng)桿菌介導(dǎo)的玫瑰茄遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立進(jìn)行了研究，首次根據(jù)擬南芥基因組數(shù)據(jù)庫提供的基因序列用PCR的方法克隆分離得到擬南芥AtPSK3基因。主要研究結(jié)果如下： 1.農(nóng)桿菌介導(dǎo)的玫瑰茄遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立

3、(1)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的玫瑰茄外植體遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立：采用10～12d的玫瑰茄無菌苗葉片和下胚軸下段作為最佳轉(zhuǎn)化受體；最佳預(yù)培養(yǎng)時(shí)間為2d；于A600約為0.5的菌液中浸泡10min的侵染效果最好；最佳共培養(yǎng)時(shí)間為3d；最適選擇壓力為50mg/L的卡那霉素(kanamycin，Kan)；最佳抑菌劑濃度為300mg/L的頭孢霉素(cefotaxine，Cef)。 (2)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的玫瑰茄愈傷組織遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立：采用中段經(jīng)過懸浮培養(yǎng)

4、的玫瑰茄愈傷組織作為轉(zhuǎn)化受體，最佳繼代培養(yǎng)基為B5+2mg/L2,4-D+0.1mg/LKT；最佳轉(zhuǎn)化時(shí)間為繼代后8～10d；附加的100μmol/L乙酰丁香酮(acetosyringone，AS)在pH值為5.6時(shí)對轉(zhuǎn)化有明顯促進(jìn)作用，A600約為0.5的菌液中浸泡10min的侵染效果最好；最佳共培養(yǎng)時(shí)間為3d，初步選擇壓力為100mg/LKan，隨繼代次數(shù)增多而逐步增加到300mg/L；最佳抑菌劑濃度為300mg/LCef。

5、 2.轉(zhuǎn)基因玫瑰茄的檢測與鑒定根據(jù)(1)和(2)最佳轉(zhuǎn)化條件獲得的抗性玫瑰茄愈傷組織生成率分別為42％和8％，GUS表達(dá)率分別為70％和50％，以有GUS活性的抗性愈傷組織組織的總DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，均得到約1.8kb的片斷。 3.基因克隆利用PCR方法，根據(jù)擬南芥基因組數(shù)據(jù)庫所提供的AtPSK3基因序列設(shè)計(jì)引物，從擬南芥基因組DNA中克隆了AtPSK3基因。序列分析結(jié)果表明，該基因全長530bp，序列與數(shù)據(jù)庫中的核苷酸