細(xì)胞核酸結(jié)合蛋白（CNBP）的功能研究.pdf

1、細(xì)胞核酸結(jié)合蛋白(cellular nucleic acid-binding protein，CNBP)是一個(gè)含有7個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)(Cys-X<,2>-Cys-X<,4>-His-Xa-Cys，CCHC)的19kD蛋白，又稱為鋅指蛋白9(zincfinger protein 9，ZNF9)。人CNBP有α與β兩種主要轉(zhuǎn)錄本，分別編碼177個(gè)和170個(gè)氨基酸。CNBP廣泛存在于真核生物中，在進(jìn)化過程中具有高度的保守性，脊椎動(dòng)物CNBP的氨基酸

2、序列同源性高達(dá)80％以上，提示它可能行使基礎(chǔ)而重要的生物學(xué)功能。CNBP可以結(jié)合DNA和RNA，具有在轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平對(duì)基因表達(dá)進(jìn)行雙重調(diào)節(jié)的能力。CNBP在各組織器官廣泛表達(dá)，在脊椎動(dòng)物胚胎發(fā)育中扮演重要角色。目前CNBP具體的生物學(xué)功能和作用途徑還不清楚。 克隆了人CNBP全長(zhǎng)cDNA，發(fā)現(xiàn)了3種新的轉(zhuǎn)錄本，包括CNBPβ變體1(編碼171個(gè)氨基酸)，CNBPp變體2(編碼172個(gè)氨基酸)，CNBPa變體1(編碼178個(gè)氨

3、基酸)。我們成功構(gòu)建了原核表達(dá)載體pET-30a(+)-CNBPβ，表達(dá)純化了CNBPβ融合蛋白，免疫新西蘭大白兔，獲得了效價(jià)高、特異性好的兔抗CNBP多克隆抗體。 為了闡釋CNBP在基因表達(dá)調(diào)控中的作用，我們利用雙螢光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)檢測(cè)了CNBP的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)能力，發(fā)現(xiàn)CNBPα與CNBPβ都具有轉(zhuǎn)錄激活能力。通過對(duì)CNBPβ氨基端與羧基端的缺失突變分析發(fā)現(xiàn)CNBPβ的轉(zhuǎn)錄激活能力依賴于蛋白質(zhì)C端區(qū)域，特別是C端含有第7鋅指的1

4、45～170位氨基酸區(qū)域，其中Thr165位潛在磷酸化位點(diǎn)是CNBP實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄激活的重要活性位點(diǎn)。 為了探尋CNBP的生物學(xué)功能，我們利用RNAi技術(shù)建立了CNBP基因沉默的HeLa細(xì)胞系，發(fā)現(xiàn)CNBP表達(dá)量下調(diào)后細(xì)胞生長(zhǎng)變慢，S期細(xì)胞減少，G<,1>期細(xì)胞增多，集落形成實(shí)驗(yàn)顯示：HeLa細(xì)胞在CNBP表達(dá)量下調(diào)后增殖能力下降，惡性程度降低。我們又建立了穩(wěn)定過表達(dá)CNBP的HeLa細(xì)胞系，發(fā)現(xiàn)CNBP表達(dá)量上調(diào)后出現(xiàn)相反的變化。這

5、表明CNBP具有促進(jìn)細(xì)胞增殖的能力。 為了進(jìn)一步揭示CNBP在體內(nèi)發(fā)揮生物學(xué)功能的分子機(jī)制，我們首先利用酵母雙雜交技術(shù)以人CNBPβ為誘餌篩查了人胎腦文庫，但未能篩選到與CNBP相互作用的蛋白質(zhì)。我們又利用基因芯片技術(shù)對(duì)CNBP基因沉默前后HeLa細(xì)胞中基因轉(zhuǎn)錄情況的差異進(jìn)行了檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)了583個(gè)差異表達(dá)的基因，對(duì)差異基因進(jìn)行功能分類分析發(fā)現(xiàn)變化的基因主要集中在發(fā)育與翻譯調(diào)節(jié)兩個(gè)方面。我們初步篩選了15個(gè)可能受CNBP調(diào)控的候選

6、基因，對(duì)其中CPS1、BMP2、ALPI、SARS等4個(gè)候選基因進(jìn)行了驗(yàn)證，初步證明了他們受CNBP的正調(diào)控；并利用雙螢光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)初步證明了ALP1基因啟動(dòng)子區(qū)可能存在對(duì)CNBP表達(dá)量變化產(chǎn)生應(yīng)答的順式作用元件。在本研究中我們發(fā)現(xiàn)了CNBP 3個(gè)新的轉(zhuǎn)錄本，利用報(bào)告基因系統(tǒng)證明CNBP具有轉(zhuǎn)錄激活能力，首次報(bào)道CNBP轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域位于蛋白質(zhì)的C端，并發(fā)現(xiàn)了重要活性位點(diǎn)。我們還證明CNBP可以通過推動(dòng)細(xì)胞周期的進(jìn)程來促進(jìn)細(xì)胞增殖