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文檔簡(jiǎn)介
1、目的:
在持續(xù)表達(dá)HBV的HepG2.215細(xì)胞模型及pBS-HBV1.3瞬時(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞模型中觀察HBV復(fù)制對(duì)HepG2細(xì)胞內(nèi)核酸識(shí)別受體及相關(guān)分子表達(dá)的影響;比較HBV(+)肝癌組織與HBV(-)肝癌組織IFI16的表達(dá)差異,并探討HBV復(fù)制與細(xì)胞內(nèi)DNA識(shí)別受體IFI16的相互作用及其機(jī)制。
方法:
1.提取HepG2及HepG2.215細(xì)胞總RNA,RT-qPCR檢測(cè)核酸識(shí)別受體及相關(guān)分子的表達(dá);
2、> 2.采用pBS-HBV1.3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞系(HepG2,Huh7),分別在不同時(shí)間點(diǎn)提取細(xì)胞總RNA,RT-qPCR檢測(cè)核酸識(shí)別受體及相關(guān)分子的表達(dá);
3.采用IHC及RT-qPCR檢測(cè)HBsAg(+)與HBsAg(-)肝癌患者肝組織及外周血白細(xì)胞IFI16表達(dá);RT-qPCR,Western blot,IF及激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)IFI16在HepG2.215細(xì)胞和HepG2細(xì)胞中的表達(dá)及分布模式;
4.采
3、用pBS-HBV1.3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞系(HepG2,Huh7),在0h,12h,24h,36h,48h后分別提取細(xì)胞總RNA及蛋白,RT-qPCR及Western blot檢測(cè)IFI16的表達(dá);ELISA檢測(cè)細(xì)胞上清中HBsAg和HBeAg表達(dá)水平;
5.采用不同濃度IFI16-FL與pBS-HBV1.3質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞,ELISA檢測(cè)細(xì)胞上清中HBsAg和HBeAg表達(dá)水平;RT-qPCR檢測(cè)細(xì)胞上清中HBV-DN
4、A水平;同樣方法檢測(cè)HepG2.215細(xì)胞過(guò)表達(dá)IFI16對(duì)HBV復(fù)制和表達(dá)的影響;
6.比較HBsAg(+)與HBsAg(-)肝癌患者外周血白細(xì)胞中IFI16,IRF3,IFN-β,NF-κB等的表達(dá)情況;IFI16-FL與pBS-HBV1.3質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞或IFI16-FL單獨(dú)轉(zhuǎn)染HepG2.215細(xì)胞,RT-qPCR檢測(cè)細(xì)胞中IFI16,IRF3,IFN-β,NF-κB等表達(dá)情況。
結(jié)果:
5、1.RT-qPCR檢測(cè)結(jié)果表明,與HepG2細(xì)胞相比,HepG2.215細(xì)胞中上調(diào)的基因包括RIG-I,MDA-5和MyD88等;下調(diào)的基因包括IFN-β,IRF-3和IFI16等;
2.pBS-HBV1.3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞系(HepG2,Huh7)后可以啟動(dòng)短暫的固有免疫應(yīng)答,激活RIG-I,IFI16等核酸識(shí)別受體一過(guò)性升高;
3.IHC結(jié)果顯示HBsAg(+)肝癌組織中IFI16蛋白呈陰性表達(dá),HBsAg(-)
6、肝癌組織中呈中度陽(yáng)性表達(dá);HBsAg(+)組外周血白細(xì)胞中IFI16 mRNA水平亦低于HBsAg(-)組;HepG2.215細(xì)胞中IFI16 mRNA的表達(dá)水平顯著低于HepG2細(xì)胞,IFI16蛋白表達(dá)量與HepG2細(xì)胞相比也顯著降低,其表達(dá)均在細(xì)胞核內(nèi);
4.pBS-HBV1.3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HepG2和Huh7后,Western blot和RT-qPCR檢測(cè)顯示IFI16的mRNA及蛋白表達(dá)水平隨時(shí)間延長(zhǎng)而遞減;ELISA結(jié)果
7、顯示細(xì)胞培養(yǎng)上清中HBsAg和HBeAg的分泌隨時(shí)間延長(zhǎng)而遞增;
5.隨著轉(zhuǎn)染IFI16真核表達(dá)質(zhì)粒的增加,HepG2細(xì)胞上清中HBV-DNA及HBsAg和HBeAg含量逐漸下降,HepG2.215細(xì)胞中檢測(cè)到相似作用;
6.共轉(zhuǎn)染IFI16-FL與pBS-HBV1.3質(zhì)粒后RT-qPCR檢測(cè)HepG2細(xì)胞中IRF3,IFNβ,NF-κB等基因的表達(dá)相對(duì)上調(diào);HepG2.215細(xì)胞轉(zhuǎn)染IFI16-FL質(zhì)粒后上述基因的
8、表達(dá)亦相對(duì)上調(diào)。
結(jié)論:
1.HepG2細(xì)胞與持續(xù)表達(dá)HBV的HepG2.215細(xì)胞之間以及轉(zhuǎn)染與未轉(zhuǎn)染pBS-HBV1.3質(zhì)粒的肝癌細(xì)胞系之間核酸識(shí)別受體及相關(guān)分子的表達(dá)存在差異,這些差異表達(dá)的分子有可能與HBV持續(xù)感染的發(fā)生相關(guān);
2.瞬時(shí)轉(zhuǎn)染和持續(xù)表達(dá)HBV的肝癌細(xì)胞系中IFI16表達(dá)下調(diào),提示HBV復(fù)制對(duì)IFI16的表達(dá)具有抑制作用,IFI16過(guò)表達(dá)亦可能通過(guò)IFI16-STING-IRF3-IFN
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