乙型肝炎病毒復(fù)制與肝細(xì)胞核酸識(shí)別受體相互作用研究.pdf

1、目的:
　　在持續(xù)表達(dá)HBV的HepG2.215細(xì)胞模型及pBS-HBV1.3瞬時(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞模型中觀察HBV復(fù)制對(duì)HepG2細(xì)胞內(nèi)核酸識(shí)別受體及相關(guān)分子表達(dá)的影響；比較HBV（+）肝癌組織與HBV（-）肝癌組織IFI16的表達(dá)差異，并探討HBV復(fù)制與細(xì)胞內(nèi)DNA識(shí)別受體IFI16的相互作用及其機(jī)制。
　　方法:
　　1.提取HepG2及HepG2.215細(xì)胞總RNA，RT-qPCR檢測(cè)核酸識(shí)別受體及相關(guān)分子的表達(dá)；

2、>　　2.采用pBS-HBV1.3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞系（HepG2，Huh7），分別在不同時(shí)間點(diǎn)提取細(xì)胞總RNA，RT-qPCR檢測(cè)核酸識(shí)別受體及相關(guān)分子的表達(dá)；
　　3.采用IHC及RT-qPCR檢測(cè)HBsAg（+）與HBsAg（-）肝癌患者肝組織及外周血白細(xì)胞IFI16表達(dá)；RT-qPCR，Western blot，IF及激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)IFI16在HepG2.215細(xì)胞和HepG2細(xì)胞中的表達(dá)及分布模式；
　　4.采

3、用pBS-HBV1.3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞系（HepG2，Huh7），在0h，12h，24h，36h，48h后分別提取細(xì)胞總RNA及蛋白，RT-qPCR及Western blot檢測(cè)IFI16的表達(dá)；ELISA檢測(cè)細(xì)胞上清中HBsAg和HBeAg表達(dá)水平；
　　5.采用不同濃度IFI16-FL與pBS-HBV1.3質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞，ELISA檢測(cè)細(xì)胞上清中HBsAg和HBeAg表達(dá)水平；RT-qPCR檢測(cè)細(xì)胞上清中HBV-DN

4、A水平；同樣方法檢測(cè)HepG2.215細(xì)胞過(guò)表達(dá)IFI16對(duì)HBV復(fù)制和表達(dá)的影響；
　　6.比較HBsAg（+）與HBsAg（-）肝癌患者外周血白細(xì)胞中IFI16，IRF3，IFN-β，NF-κB等的表達(dá)情況；IFI16-FL與pBS-HBV1.3質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞或IFI16-FL單獨(dú)轉(zhuǎn)染HepG2.215細(xì)胞，RT-qPCR檢測(cè)細(xì)胞中IFI16，IRF3，IFN-β，NF-κB等表達(dá)情況。
　　結(jié)果:
　　

5、1.RT-qPCR檢測(cè)結(jié)果表明，與HepG2細(xì)胞相比，HepG2.215細(xì)胞中上調(diào)的基因包括RIG-I，MDA-5和MyD88等；下調(diào)的基因包括IFN-β，IRF-3和IFI16等；
　　2.pBS-HBV1.3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞系（HepG2，Huh7）后可以啟動(dòng)短暫的固有免疫應(yīng)答，激活RIG-I，IFI16等核酸識(shí)別受體一過(guò)性升高；
　　3.IHC結(jié)果顯示HBsAg（+）肝癌組織中IFI16蛋白呈陰性表達(dá)，HBsAg（-）

6、肝癌組織中呈中度陽(yáng)性表達(dá)；HBsAg（+）組外周血白細(xì)胞中IFI16 mRNA水平亦低于HBsAg（-）組；HepG2.215細(xì)胞中IFI16 mRNA的表達(dá)水平顯著低于HepG2細(xì)胞，IFI16蛋白表達(dá)量與HepG2細(xì)胞相比也顯著降低，其表達(dá)均在細(xì)胞核內(nèi)；
　　4.pBS-HBV1.3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HepG2和Huh7后，Western blot和RT-qPCR檢測(cè)顯示IFI16的mRNA及蛋白表達(dá)水平隨時(shí)間延長(zhǎng)而遞減；ELISA結(jié)果

7、顯示細(xì)胞培養(yǎng)上清中HBsAg和HBeAg的分泌隨時(shí)間延長(zhǎng)而遞增；
　　5.隨著轉(zhuǎn)染IFI16真核表達(dá)質(zhì)粒的增加，HepG2細(xì)胞上清中HBV-DNA及HBsAg和HBeAg含量逐漸下降，HepG2.215細(xì)胞中檢測(cè)到相似作用；
　　6.共轉(zhuǎn)染IFI16-FL與pBS-HBV1.3質(zhì)粒后RT-qPCR檢測(cè)HepG2細(xì)胞中IRF3，IFNβ，NF-κB等基因的表達(dá)相對(duì)上調(diào)；HepG2.215細(xì)胞轉(zhuǎn)染IFI16-FL質(zhì)粒后上述基因的

8、表達(dá)亦相對(duì)上調(diào)。
　　結(jié)論:
　　1.HepG2細(xì)胞與持續(xù)表達(dá)HBV的HepG2.215細(xì)胞之間以及轉(zhuǎn)染與未轉(zhuǎn)染pBS-HBV1.3質(zhì)粒的肝癌細(xì)胞系之間核酸識(shí)別受體及相關(guān)分子的表達(dá)存在差異，這些差異表達(dá)的分子有可能與HBV持續(xù)感染的發(fā)生相關(guān)；
　　2.瞬時(shí)轉(zhuǎn)染和持續(xù)表達(dá)HBV的肝癌細(xì)胞系中IFI16表達(dá)下調(diào)，提示HBV復(fù)制對(duì)IFI16的表達(dá)具有抑制作用，IFI16過(guò)表達(dá)亦可能通過(guò)IFI16-STING-IRF3-IFN