體外進(jìn)化ATP結(jié)合蛋白的初步功能研究.pdf

1、基于小分子配體的保守性，我們實(shí)驗(yàn)室提出了原始蛋白結(jié)構(gòu)起源的小分子誘導(dǎo)模型，認(rèn)為最早產(chǎn)生的蛋白質(zhì)是由ATP誘導(dǎo)選擇產(chǎn)生的。采用cDNA展示技術(shù)，對(duì)該假說(shuō)進(jìn)行了初步驗(yàn)證，獲得的豐度最高的蛋白質(zhì)具有ATP結(jié)合能力及ATP水解活性。本課題在該研究基礎(chǔ)上，對(duì)篩選得到的豐度最高蛋白質(zhì)進(jìn)行了初步的功能研究，主要內(nèi)容包括對(duì)體外進(jìn)化ATP結(jié)合蛋白的生化性質(zhì)測(cè)定及互作蛋白的篩選研究。
　　首先，設(shè)計(jì)新引物，以NcoⅠ和EcoRⅠ作為酶切位點(diǎn)，構(gòu)建原核

2、表達(dá)載體pET-28b-abp1，自誘導(dǎo)表達(dá)獲得高濃度全長(zhǎng)蛋白。BAC試劑盒進(jìn)行定量檢測(cè)蛋白濃度為2.11 mg/mL。核磁共振法解析蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)主要以α-Helix和無(wú)規(guī)卷曲的二級(jí)結(jié)構(gòu)形式存在。測(cè)定蛋白質(zhì)與ATP結(jié)合常數(shù)Kd值為0.303±0.073μM。
　　其次，鉬酸鹽-孔雀石綠分光光度法對(duì)蛋白進(jìn)行了酶活性質(zhì)的測(cè)定，發(fā)現(xiàn)該蛋白同時(shí)具有ATPase、UTPase、GTPase、CTPase四種酶活性，其中ATPa

3、se活性最強(qiáng)。使用HPLC法研究蛋白質(zhì)水解ATP生成的產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)水解ATP生成的主要產(chǎn)物是ADP。在20-100mM濃度范圍內(nèi)隨著蛋白酶濃度增加，酶活增大。在最適酶活條件的測(cè)定中發(fā)現(xiàn)，酶促反應(yīng)的最適溫度為45℃，該溫度高于普通酶的最適溫度，由于原始環(huán)境溫度偏高，也恰好能夠說(shuō)明我們的蛋白具有早起源蛋白的特性;酶促反應(yīng)最適pH值為8.0;40 mM蛋白酶的體系中最適底物濃度為12.5μM;并發(fā)現(xiàn)隨著鹽離子濃度增加，蛋白質(zhì)酶活降低。