玫瑰孢鏈霉菌中argR調(diào)控達(dá)托霉素生物合成機制的研究.pdf

1、背景：達(dá)托霉素為新型環(huán)脂肽類抗生素，是治療由革蘭氏陽性耐藥菌株所引起感染的最佳治療藥物，因其對 MRSA（耐甲氧西林金黃色葡萄球菌）、VRE（耐萬古霉素的腸球菌）和PRSP（耐青霉素的肺炎鏈球菌）等高致病臨床耐藥菌株有很好的殺菌作用，因此被譽為“超級抗生素”。達(dá)托霉素是由玫瑰孢鏈霉菌S. roseosporus NRRL15998通過非核糖體肽合成酶（NRPS）所產(chǎn)生的環(huán)脂肽類抗生素復(fù)合物中很小的一個組分。由于其在臨床上重要的應(yīng)用價值，

2、且在玫瑰孢鏈霉菌中產(chǎn)量很低，不能滿足臨床治療和生產(chǎn)的需要，促使我們研究達(dá)托霉素的合成調(diào)控機制，通過代謝工程和合成生物學(xué)方法來提高達(dá)托霉素產(chǎn)量。ArgR是細(xì)菌中普遍存在的調(diào)控精氨酸代謝的調(diào)控因子，在調(diào)控精氨酸代謝的同時也能調(diào)控其他代謝途徑相關(guān)基因的表達(dá)。在鏈霉菌中，ArgR是精氨酸生物合成基因的調(diào)控因子。精氨酸或參與精氨酸生物合成的氨基酸是眾多次級代謝產(chǎn)物合成的前體，因此ArgR廣泛調(diào)控次級代謝的生物合成；ArgR在棒狀鏈霉菌中參與嘌呤、

3、棒酸的代謝調(diào)控及全霉素的生物合成；在天藍(lán)色鏈霉菌中參與次級代謝過程中色素的合成和相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控；精氨酸生物合成的中間產(chǎn)物鳥氨酸是達(dá)托霉素的重要前體，ArgR是否調(diào)控達(dá)托霉素的合成及其分子機制是一個重要的科學(xué)問題。
　　目的：利用蛋白質(zhì)組學(xué)方法比較野生型與兩株不同來源的達(dá)托霉素高產(chǎn)菌株，發(fā)現(xiàn)在兩株高產(chǎn)菌株中ArgR的表達(dá)顯著下調(diào)，ArgJ表達(dá)也下調(diào)，而ArgG表達(dá)上調(diào)，暗示ArgR可能影響達(dá)托霉素生物合成，本研究旨在S. ros

4、eosporus NRRL15998中闡明ArgR對達(dá)托霉素生物合成機制的調(diào)控作用，ArgR對發(fā)育分化及次級代謝抗生素生物合成的影響，為解析ArgR在玫瑰孢鏈霉菌中的生物學(xué)功能、調(diào)控分子機制和提高達(dá)托霉素產(chǎn)量提供依據(jù)。
　　方法：⑴對S.roseosporus基因組序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析，在玫瑰孢鏈霉菌基因組中確定編碼精氨酸抑制因子ArgR的基因argR；利用ClustalX、ESpript軟件對ArgR蛋白的同源性進(jìn)行比對；對A

5、rgR蛋白的保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行初步預(yù)測；⑵為研究S.roseosporus中argR的功能，在本實驗室構(gòu)建的玫瑰孢鏈霉菌Fosmid文庫的基礎(chǔ)上，通過PCR-targeting方法，利用同源重組的原理在S. roseosporus中構(gòu)建 argR敲除菌株，以 pSET152-kan載體出發(fā)構(gòu)建遺傳互補菌株，以pIJ8660-ermE*p載體出發(fā)構(gòu)建過表達(dá)菌株；⑶為在S.roseosporus中研究argR對發(fā)育分化的影響，在不同培養(yǎng)基和含有

6、不同金屬離子的AS-I培養(yǎng)基中對玫瑰孢鏈霉菌菌絲發(fā)育分化進(jìn)行研究，比較突變菌株和野生型菌株之間表型的差異來研究argR對發(fā)育分化的影響；⑷通過實時熒光定量PCR（qRT-PCR）實驗探究S. roseosporus中argR對精氨酸生物合成基因簇兩個轉(zhuǎn)錄單元轉(zhuǎn)錄水平的影響；通過半定量 PCR（RT-PCR）實驗探究S. roseosporus中argR是否能夠激活基因組中沉默基因簇的表達(dá)；⑸為研究argR對次級代謝生物合成的影響，對野生

7、型、敲除株、回補株及過表達(dá)株進(jìn)行了發(fā)酵實驗，以藤黃微球菌為指示菌對發(fā)酵液的生物活性進(jìn)行了檢測；繪制菌體生長曲線和抗生素產(chǎn)量的實時曲線。通過qRT-PCR實驗進(jìn)一步證實argR對次級代謝達(dá)托霉素生物合成的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用；㈥構(gòu)建ArgR蛋白表達(dá)載體pET23b-ArgR，純化ArgR蛋白，通過EMSA實驗初步探究 ArgR蛋白對精氨酸生物合成基因簇及達(dá)托霉素生物合成基因簇中關(guān)鍵基因的結(jié)合能力；
　　結(jié)果：①在S.roseosporus中

8、確定argR在基因組中的位置為SSGG_00667。以Fosmid文庫質(zhì)粒為基礎(chǔ)，在S. roseosporus中成功構(gòu)建argR的敲除株argRDM、互補株argRDMC和過表達(dá)株argROE；②在固體培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基中觀察WT、argRDM和argROE生長狀況，發(fā)現(xiàn)菌絲表型沒有差別，產(chǎn)孢及產(chǎn)色素情況沒有差異，WT和argRDM能在含有0.25M鈣離子的培養(yǎng)基中產(chǎn)孢，而argROE幾乎不產(chǎn)孢，且argRDM的產(chǎn)孢量是WT的170倍

9、，并用掃描電鏡觀察證實argR敲除后能夠促進(jìn)菌絲分化；③S.roseosporus中argR敲除后使A21978C產(chǎn)量降低21％，而過表達(dá)使次級代謝抗生素的產(chǎn)量提高1.6倍；④與WT相比argRDM能夠使調(diào)控達(dá)托霉素產(chǎn)量的關(guān)鍵基因atrA、dptE、dptR2和dptR3的轉(zhuǎn)錄水平在48h分別降低26%、21.36%、73.28%和27.12%，72h分別降低51.15%、75.45%、77.88%和29.82%，96h分別降低65.8

10、7%、25.09%、15.07%和18.75%，而調(diào)控精氨酸生物合成的兩個轉(zhuǎn)錄單元argCJBDR和argGH的轉(zhuǎn)錄水平平均提高60倍和100倍左右；⑤構(gòu)建ArgR蛋白表達(dá)載體pET23b-ArgR,并純化ArgR蛋白，濃度為8mg/mL；⑥通過EMSA實驗證實ArgR對atrA、dptE、dptR2、dptR3、argCJBDR和argGH都有不同程度的結(jié)合作用；⑦在S.roseosporus中argR基因的突變不能夠激活特定沉默基因

11、簇中基因的表達(dá)；⑧對WT、argRDM菌體和發(fā)酵液中氨基酸含量進(jìn)行檢測發(fā)現(xiàn)絲氨酸含量分別降低39.72％和13.1％，精氨酸含量分別升高77.44%和180.43%；
　　結(jié)論：結(jié)果顯示S.roseosporus中argR對菌絲生長發(fā)育沒有顯著的影響，在鈣離子豐富的培養(yǎng)基中能夠顯著影響孢子產(chǎn)量；argR能夠影響次級代謝抗生素的生物合成，即argR能夠影響初級代謝過程中前體絲氨酸的合成而調(diào)控達(dá)托霉素的產(chǎn)生；并且argR能夠調(diào)控關(guān)鍵基