吸水鏈霉菌17997中格爾德霉素生物合成基因簇的研究.pdf

1、吸水鏈霉菌17997是該所從中國(guó)土壤中分離得到的格爾德霉素(GDM)產(chǎn)生菌。GDM屬于苯安莎類抗生素。最先發(fā)現(xiàn)GDM具有抗原蟲和抗腫瘤作用，最近我所的研究發(fā)現(xiàn)GDM還具有良好的抗病毒活性。國(guó)外的研究表明GDM的這些生物學(xué)活性是因?yàn)樗芴禺愋缘匾种茻嵝菘说鞍?0的ATP/ADP結(jié)構(gòu)域，下調(diào)多種Hsp90的靶蛋白功能所致，包括酪氨酸激酶、類固醇激素受體和轉(zhuǎn)錄因子等。GDM作為Hsp90的特異性抑制劑，成為在抗癌和抗病毒領(lǐng)域中非常有潛力的藥物

2、。但因?yàn)镚DM肝毒性比較大，水溶性不好，所以尋找其低毒可溶性好的衍生物成為當(dāng)今研究的主要目標(biāo)。GDM的一種衍生物17-烯丙氨基-17-脫甲氧基GDM(17-AAG)正在美國(guó)進(jìn)行Ⅱ期臨床實(shí)驗(yàn)。 已知安莎類抗生素的生物合成是以3-氨基-5-羥基苯甲酸(AHBA)為起始單位，由Ⅰ型聚酮合酶(PKS)催化順序加上乙二酸，丙二酸或者甲氧基丙二酸等延伸單位，在酰胺合酶參與下形成聚酮體骨架，然后再進(jìn)行后續(xù)的加工。在對(duì)GDM生物合成基因簇的研究

3、中，本實(shí)驗(yàn)室在S.hygroscopicus17997中曾發(fā)現(xiàn)了苯醌型和萘醌型兩種AHBA生物合成基因和與之連鎖的兩個(gè)PKS基因簇，但其中未包括GDM的后修飾基因。本研究根據(jù)GDM的后修飾基因-氨甲?；D(zhuǎn)移酶基因(gdmN)的保守序列設(shè)計(jì)PCR引物，在S.hygroscopicus17997基因組中擴(kuò)增出了732bp的基因片段，通過測(cè)序和同源比較，證實(shí)該基因片段與S.hygroscopicusNRRL3602的gdmN有94％的同源性。

4、利用該基因片段的引物，進(jìn)行菌落PCR篩選S.hygroscopicus17997的基因組文庫，獲得了6個(gè)陽性克隆，并利用732bp的PCR產(chǎn)物作為探針對(duì)陽性克隆進(jìn)行Southernblot驗(yàn)證和定位。選擇CT-4陽性柯斯質(zhì)粒進(jìn)行亞克隆測(cè)序，將測(cè)得的28.356kbDNA序列進(jìn)行BLAST和ORF分析，證實(shí)與公布的S.hygroscopicusNRRL3602GDM生物合成基因的部分序列基本一致。CT-4柯斯質(zhì)?？寺≈型庠葱蛄锌赡馨?2

5、個(gè)基因：與gdmA3基因同源的PKS基因、酰胺合酶基因(gdmF)、單加氧酶基因(gdmM)、氨甲?；D(zhuǎn)移酶基因(gdmN)、與甲氧基丙二酰-?；鶖y帶蛋白合成相關(guān)的5個(gè)基因(gdmH、I、J、K和G)、LuxR家族的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)基因(gdmRⅡ)、氨基奎尼酸合成酶基因(gdmO)，細(xì)胞色素P450氧化還原酶基因(gdmP)。從17997的基因組中通過PCR延伸獲得另一LuxR家族的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)基因(gdmRⅠ)。 LuxR家族調(diào)節(jié)基因g

6、dmRⅠ和gdmRⅡ阻斷變株(RⅠ和RⅡ變株)均不產(chǎn)生GDM，說明這兩個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)基因可能是GDM生物合成的正調(diào)控基因。S.hygroscopicu17997發(fā)酵培養(yǎng)的生長(zhǎng)期為12-48h，合成期為48-96h。提取不同培養(yǎng)時(shí)間的S.hygroscopicu17997、RⅠ和RⅡ變株的總RNA，通過半定量RT-PCR研究了兩個(gè)調(diào)節(jié)基因gdmRⅠ和gdmRⅡ和GDM生物合成相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄的關(guān)系。結(jié)果表明gdmRⅠ和gdmRⅡ基因在72h開始轉(zhuǎn)