假單胞菌株M18藤黃綠菌素的生物合成基因簇、調(diào)控基因pltZ及其ABC轉(zhuǎn)運基因簇的鑒定與功能研究.pdf

1、假單胞菌株(Pseudomonassp.)M18產(chǎn)生藤黃綠菌素(Pyoluteorin，Plt)與吩嗪-1-羧酸(Phenazine-1-carboxylicacid，PCA)兩種不同類型的抗生素，能抑制多種植物病原菌，是一株重要的生物防治菌株。本研究克隆、測序并鑒定了M18藤黃綠菌素生物合成基因簇及其下游序列共32.8kb的基因組區(qū)域，序列分析發(fā)現(xiàn)該區(qū)域共包含20個開放閱讀框(ORF)，plt基因簇由位于其中22-kb基因組區(qū)域的10

2、個ORF組成：操縱子pltLABCDEFG、轉(zhuǎn)錄調(diào)控基因pltR、部分pltM基因，M18plt基因簇的基因組成、分布、大小與熒光假單胞菌Pf-5的基本相似。在plt基因簇下游8-kb基因組區(qū)域，首次發(fā)現(xiàn)并鑒定了一個新的藤黃綠菌素生物合成負調(diào)控基因pltZ和一個新的涉及藤黃綠菌素免疫、促進藤黃綠菌素合成與分泌的ABC(ATP-bindingcassette)轉(zhuǎn)運基因簇pltHIJKNO，并預測提出了一個可能的藤黃綠菌素轉(zhuǎn)運機制模型。在p

3、ltZ和pltHIJKNO功能鑒定的基礎上，本課題還研究證實：pltZ轉(zhuǎn)錄阻抑ABC轉(zhuǎn)運系統(tǒng)PltHIJKNO的表達，藤黃綠菌素能同時誘導自身生物合成基因和ABC轉(zhuǎn)運系統(tǒng)PltHIJKNO的表達。研究藤黃綠菌素生物合成的分子調(diào)控、轉(zhuǎn)運分泌及自身免疫機制，對于通過基因工程提高抗生素產(chǎn)量及其生物防治能力、實現(xiàn)抗生素生產(chǎn)工業(yè)化具有十分重要的意義。 pltZ編編碼蛋白質(zhì)序列與其它TetR家族細菌調(diào)控蛋白具有廣泛的同源性，PltZ蛋白的第

4、19～65個氨基酸殘基間存在一個TetR家族調(diào)控蛋白的特征序列模體，其中第23～59個氨基酸殘基編碼一個HTH(helix-turn-helix)DNA結合結構域。pltZ基因的突變引起藤黃綠菌素合成量比野生型提高4.4倍，而對吩嗪-1-羧酸的合成沒有影響。pltZ對藤黃綠菌素生物合成的負調(diào)控作用通過pltZ的過表達實驗與pltA'-'lacZ翻譯融合分析得到進一步證實。 藤黃綠菌素ABC轉(zhuǎn)運基因簇位于pltZ下游7.5kb基因

5、組區(qū)域內(nèi)，由pltH、I、J、K、N、O六個基因組成，作為一個單獨的轉(zhuǎn)錄子，在pltZ相反方向轉(zhuǎn)錄，生物信息學分析預測顯示：這六個基因依次分別編碼一個膜融合蛋白PltH、一個Ⅱ型ATP結合蛋白PltI、兩個內(nèi)膜整合通透酶蛋白PltJ與PltK、一個外膜通道蛋白PltN及一個跨膜蛋白PltO，共同組成一個完整的ABC轉(zhuǎn)運系統(tǒng)。Plt的生物合成需要該ABC轉(zhuǎn)運系統(tǒng)的表達，pltH或pltI的突變菌株均未合成可探測水平的Plt，ABC轉(zhuǎn)運系統(tǒng)

6、的過表達顯著提高M18菌株合成Plt的能力。在大腸桿菌DH5α菌株中異源表達ABC轉(zhuǎn)運基因簇不同基因或區(qū)域，測定該菌株對Plt的敏感性(最小抑制濃度)；在含有15μgmL-1和12.5μgmL-1Plt的LB培養(yǎng)基中，分別測定攜帶完整ABC轉(zhuǎn)運系統(tǒng)表達質(zhì)粒pZX141的E.coliDH5α與空質(zhì)粒(pME6032)對照菌株的生長動力學；兩實驗結果表明：完整的ABC轉(zhuǎn)運系統(tǒng)負責對Plt的免疫或抗性。ABC轉(zhuǎn)運系統(tǒng)對Plt生物合成的促進功能

7、及其Plt抗性機制均可能由該ABC轉(zhuǎn)運系統(tǒng)分泌與外排Plt的功能所介導，就此提出了一個可能的Plt轉(zhuǎn)運機制模型。 在野生型M18菌株和pltZ突變菌株M18Z中，ABC轉(zhuǎn)運基因pltH'-‘lacZ翻譯、轉(zhuǎn)錄融合表達的結果表明：pltZ轉(zhuǎn)錄阻抑PltABC轉(zhuǎn)運系統(tǒng)的表達。pltZ有可能通過阻抑PltABC轉(zhuǎn)運系統(tǒng)的表達，間接地負調(diào)控Plt的生物合成。 在添加或不添加外源Plt(終濃度10μgmL-1)的KMB培養(yǎng)基中，分