鞘氨醇單胞菌JS061咔唑降解基因簇上游基因的分離和鑒定.pdf

1、咔唑是典型的含氮雜環(huán)芳烴污染物，具有致毒、致癌和致突變的“三致”作用，會給環(huán)境和人類帶來巨大的危害。微生物在環(huán)境治理方面具有高效、專一、經(jīng)濟和節(jié)能等諸多優(yōu)點，所以本實驗利用微生物作為實驗材料研究了咔唑降解的機制。本研究選擇了從咔唑污染土樣中分離得到的一株能夠降解咔唑的革蘭氏陰性菌鞘氨醇單胞菌JS061作材料來研究咔唑降解過程中各基因的特點及其編碼的酶蛋白的性質(zhì)。 從鞘氨醇單胞菌JS061菌株的基因組DNA中分離得到降解咔唑的上

2、游基因的基因簇，利用軟件和BLAST分析之后，證實我們獲得了完整的降解咔唑的上游基因。將該序列提交GenBank，獲得了該基因的序列號為EU854302。從BLAST比對結(jié)果和結(jié)果中發(fā)現(xiàn)該基因簇是由基因carAaBCAc構(gòu)成，并且明確了該菌株中這幾個基因的排列順序為carAa→carB→carC→carAc。通過Southern雜交驗證了該基因簇是來自于鞘氨醇單胞菌JS061基因組，并且以單拷貝的形式存在。 利用pET28a(

3、+)質(zhì)粒分別構(gòu)建了carAa，carAc，carB和carC基因的原核表達(dá)載體，實現(xiàn)了這四種蛋白在BL21(DE3.0)中的表達(dá)。確定了這四種蛋白的分子量分別為43kDa，15kDa，29kDa(CarBa)/10kDa(CarBb)和31kDa。但構(gòu)成carB的兩個組分CarBa和CarBb的表達(dá)比例上與其他菌種表達(dá)的CarB蛋白有很大差別。同時本研究利用底物顯色反應(yīng)驗證了pETWB重組質(zhì)粒中表達(dá)的CarB蛋白具有裂解2，3-二羥基聯(lián)

4、苯的生物學(xué)活性。 本實驗利用Ni-NTAagarose成功的純化了含有六個組氨酸的CarB和CarC融合蛋白，并利用BALB/c雌性小鼠制備了CarC蛋白的多克隆抗體。利用該抗體在蛋白水平檢測了Sphingomonassp.JS061中carC蛋白在不同底物濃度時的表達(dá)情況以及在相同濃度下不同誘導(dǎo)時間的蛋白表達(dá)情況。結(jié)果證實了該蛋白只有在有底物存在時才表達(dá)，而且在誘導(dǎo)時間相同、底物濃度不同時蛋白表達(dá)有明顯的差別，證明了降解咔唑