鞘氨醇單胞菌USTB-05降解微囊藻毒素-LR特性及酶學(xué)途徑研究.pdf

1、本文以從滇池底泥分離出來的能高效降解微囊藻毒素（microcystins，MCs）的鞘氨醇單胞菌（Sphingopyxis sp.）USTB-05為研究對象，通過研究USTB-05菌降解MCs的特性，利用碳納米管（Carbon Nanotubes，CNTs）加載細(xì)菌去除MCs，進(jìn)一步提高細(xì)菌降解MCs的效率；對USTB-05降解MCs基因進(jìn)行分子克隆、構(gòu)建重組菌、純化重組菌酶、檢測重組菌酶降解MCs產(chǎn)物，初步探索USTB-05菌降解MC

2、s酶學(xué)途徑。具體研究內(nèi)容和結(jié)果如下：
　?。?）USTB-05菌能在4 h內(nèi)將9.58 mg/L的微囊藻毒素-LR（MC-LR）完全降解；含蛋白濃度為350 mg/L的USTB-05菌無細(xì)胞提取液(Cell free extract，CE)，能在8 h內(nèi)將11.6 mg/L的 MC-LR完全降解；同時(shí)利用單壁碳納米管（Single-Walled Carbon Nanotubes，SWCNTs）和CE對MC-LR降解效率，比單獨(dú)使用

3、USTB-05菌CE增強(qiáng)了10%；兩種 CNTs加載相同濃度 USTB-05菌酶降解 MC-LR的平均速率比較：SWCNTs+USTB-05菌酶>多壁碳納米管(Multi-Walled Carbon Nanotubes，MWCNTs)+USTB-05菌酶。
　?。?）通過引物設(shè)計(jì)及目的基因的PCR擴(kuò)增等基因工程技術(shù)，得到降解基因。通過構(gòu)建重組質(zhì)粒pT15/USTB-05-A、pET30a(+)/USTB-05-B和pET30a(+

4、)/USTB-05-C，并將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至E.coli BL21(DE3)，分別獲得重組菌A、重組菌B和重組菌C。
　?。?）通過利用Ni-IDA親和柱對破碎后的重組菌A、重組菌B和重組菌C的CE分別進(jìn)行蛋白純化，純化后的蛋白采用Bradford法測定蛋白濃度，依次為1 mg/mL、0.2 mg/mL、1.2 mg/mL。經(jīng)R250染色的SDS-PAGE膠評估，純化后的蛋白純度分別為95.4%、91.1%、91.6%。
　?。?

5、）同時(shí)利用CNTs和重組菌降解MCs的效率比單獨(dú)使用重組菌增強(qiáng)39%；含蛋白濃度350 mg/L重組菌CE能在2 h內(nèi)將11.6 mg/L的MC-LR完全降解；兩種CNTs加載相同濃度重組菌酶降解MC-LR的平均速率對比：MWCNTs+重組菌酶>SWCNTs+重組菌酶。
　?。?）通過對重組菌表達(dá)的3種高效酶降解MC-LR及產(chǎn)物的研究，使用高效液相色譜技術(shù)，檢測MC-LR降解產(chǎn)物。結(jié)果表明，USTB-05菌的第一種酶能快速催化降解