鰻弧菌(Vibrio anguillarum)M3菌株T6SS基因簇的克隆及其功能的初步研究.pdf

1、細菌T6SS分泌系統(tǒng)(TypeⅥ secretion system，T6SS)是最近報道的-個新的蛋白分泌系統(tǒng)。根據鰻弧菌(Vibrio anguillarum)Fosmid文庫獲得的部分基因組序列信息，發(fā)現鰻弧菌存在T6SS分泌系統(tǒng)的同源基因。通過同源克隆、genomic Walking等方法，獲得了鰻弧菌M3菌株的T6SS分泌系統(tǒng)基因簇。該基因簇含有22879bp，編碼16個ORF，GC含量為46.93％，與V．cholerae有最

2、高相似性，為87％。為了確定鰻弧菌M3的T6SS基因的轉錄是否受-個操縱子調控，通過跨兩個連續(xù)基因設計引物進行PCR和生物信息學分析結合的方法，發(fā)現在鰻弧菌T6SS基因簇的基因vaa108上游存在-個啟動子，來調控M3整個T6SS基因的轉錄。 為了研究T6SS基因的功能，通過In-frame-deletion的方法構建了7個基因的缺失突變株，研究了這些突變株的生長、泳動性、胞外酶產生和毒力等方面的變化。結果表明，在生長方面，4株

3、突變株在在對數生長期的生長速度比野生型菌株顯著加快(p＜0.05)、1株突變株的生長稍微減慢、2株突變株的生長沒有明顯變化；在泳動性方面，2株突變株的泳動性增強(P＜0.05)，其他突變株則沒有顯著變化；1株突變株的α-葡萄糖苷酶活性明顯高于野生株。以突變株對藍曼龍魚(Trichoqaster trichopterus)進行攻毒檢測半數致死量(LD50)，結果發(fā)現有4株突變株的毒力沒有明顯變化或變化不明顯，3株突變株的毒力37～223倍

4、。這些結果表明，鰻弧菌T6SS可能參與了細菌的毒力。 生物信息學分析發(fā)現，鰻弧菌基因簇內命名為vaa117的基因編碼sigma54轉錄調節(jié)因子。 研究發(fā)現，vaa117基因缺失突變后，鰻弧菌菌膜形成能力有明顯變化，在48-72h菌膜形成不僅快于野生型菌株，而且菌膜形成量也高于野生型。表明鰻弧菌的菌膜形成受到vaa117基因的負調控。進一步研究發(fā)現，vaa117基因缺失突變后，鰻弧菌溶血素共調蛋白(hemolysi-cor