銅綠假單胞菌T6SS效應蛋白Tsel、Tse3及其免疫蛋白Tsil、Tsi3結構與功能的研究.pdf

1、病原菌在侵染宿主時，一方面要獲取一定的營養(yǎng)供給，另一方面也要確保自身在侵染過程中能夠成功逃逸宿主免疫系統(tǒng)的清除。這些功能的實現(xiàn)，就主要依賴于細菌的分泌系統(tǒng)來完成。分泌系統(tǒng)所涉及的蛋白，包括細菌合成后儲存于自身細胞中或細胞表面，或者是分泌到周圍環(huán)境中，再或者是注入宿主細胞體內(nèi)，這些分泌蛋白參與了細菌諸多的生物過程，如，細菌侵染時的毒力，鞭毛合成及功能的實現(xiàn)，對宿主相關系統(tǒng)的改造和利用以及對藥物的抗性等。
　　 目前，在作為動植物病

2、原菌的革蘭氏陰性菌中，已發(fā)現(xiàn)7種相關的分泌系統(tǒng)，依次命名為T1SS至T7SS。這些分泌系統(tǒng)可大致分為一步或者兩步分泌系統(tǒng)，其中，一步分泌系統(tǒng)包括T1SS，T3SS和T4SS，它們一般直接通過一個導管穿過細菌的外膜;兩步反應的分泌系統(tǒng)，其底物蛋白需要先通過一般的分泌途徑(Sec translocon)或者是雙-精氨酸轉運途徑(Tat)，轉運跨過內(nèi)膜進入周質(zhì)空間，第二步，將N端信號序列切除，底物蛋白被轉運出細胞，二步分泌系統(tǒng)包括T2SS和T

3、5SS。與上述幾種分泌系統(tǒng)相比，關于T6SS的組裝和生物合成，我們還知之甚少。有研究組，已定位一個包含15-20個保守開放閱讀框的基因簇，這個基因簇被認定可用來編碼T6SS結構組件蛋白。一般認為，T6SS由13個作為核心組件的亞基形成一個微型裝置(minimal apparatus)，這些核心組件還可再與其它蛋白存在相互作用。這些核心組件中，有一些與噬菌體尾部，刺突，鞘或者基板等相似的結構，另一些蛋白可插入到內(nèi)膜或外膜上，從而將這個噬菌

4、體樣結構錨定在細胞外膜上?，F(xiàn)在，普遍的模型認為，這些核心組件共同形成一個可錨定在細菌外膜上的倒轉的噬菌體樣結構。同時，在T6SS膜上相關蛋白中，鑒定出與T4SS相似的組分，提示我們，T6SS可能是T4SS和噬菌體尾管組成的鑲嵌體。Joseph D.Mougous研究組，在銅綠假單胞菌中鑒定了三個T6SS底物（或稱效應蛋白），依次命名為Tse1-3（type six exported1-3）。Tse2被鑒定為毒素-免疫體系的毒素成分，輸入

5、至缺乏相應免疫抑制蛋白的受體細胞細胞質(zhì)中，以目前尚且未知的機制，引起宿主細胞的生長停滯，從而保證銅綠假單胞菌在微環(huán)境中的生長競爭優(yōu)勢。Tse1和Tse3定位于受體細胞的周質(zhì)空間，可降解受體細胞細胞壁。同時，銅綠假單胞菌就需要進化出一套相應的可抑制自身Tse作用的免疫蛋白Tsi(typeⅥ secretion immunity protein)，從而成功避免其被自身的Tse所損傷。該研究組用Tse1和Tse3處理提取的Escherichi

6、a coli細胞壁，并對酶解產(chǎn)物進行HPLC-MS分析，實驗數(shù)據(jù)證明Tse1具有酰胺酶（DL-內(nèi)肽酶）活性，屬于Tae（typeⅥ amidase effector）超家族，作用位點為肽聚糖γ-D-Glu-L-meso-diaminopimelic acid(γ-D-Glu-m-DAP)間的肽鍵;Tse3具有溶菌酶活性，水解糖主鏈上N-乙酰胞壁酸(MurNAc)和N-乙酰葡萄糖胺(Gl cNAc)間的β-1，4糖苷鍵。
　　 結

7、構生物學，研究生物大分子的性質(zhì)以及分子之間的相互作用，其優(yōu)勢在于，在結構決定功能的理論指導下，獲得大分子的三維空間結構，可以幫助我們更好地理解大分子的生物學功能，以及發(fā)現(xiàn)它未曾被揭示的功能。Tsi2結構的解析，是研究T6SS效應蛋白-免疫抑制蛋白結構和功能的第一步，但是Tse2-Tsi2復合物的結構尚未解析，因此闡明銅綠假單胞菌T6SS效應蛋白-免疫抑制蛋白的相互作用機制，以及詮釋T6SS這個精密轉運機器的運轉機制，依然有很多相關工作要

8、繼續(xù)。
　　 本文研究目的和研究內(nèi)容:
　　 在功能研究組的工作基礎上，本課題借助X射線晶體學手段，我們期望通過解析Tse1單體，Tse3單體，Tse1-Tsi1復合物和Tse3-Tsi3復合物三維結構，最好還能獲得Tse與底物肽聚糖的復合物結構，并結合相關生化佐證實驗，更好地從分子層面闡釋Tse1和Tse3對抗與其競爭的革蘭氏陰性菌以及可成功保護自身的機制，同時建立一個可較全面解析T6SS攻擊宿主細胞的普遍的模式框架，

9、并為最終控制和預防銅綠假單胞菌感染，提供新的靶向治療視角。具體研究內(nèi)容如下:
　　 1)解析Tse1及Tse1-Tsi1復合物的三維結構，分析其相互作用界面，識別機制及Tsi1抑制Tse1酰胺酶活性的分子機理，并分析Tsi1與Tse1高特異性相互作用的機制。我們解析了Tse1單體和Tse1-(6-148)-Tsi1-(20-end)復合物結構，分辨率分別為1.4(A)和1.6(A)(1(A)=0.1 nm)。
　　 2)

10、在大腸桿菌細胞周質(zhì)空間中轉入Tse1表達載體并誘導其表達，進行大腸桿菌生長曲線測定，驗證Tse1對大腸桿菌（革蘭氏陰性菌）細胞壁的降解作用。
　　 3)通過活性中心關鍵氨基酸殘基突變，分析Tse1催化機制，驗證其酰胺酶活性。
　　 本課題的創(chuàng)新點如下:
　　 1)通過Tse1三維結構分析，表明Tse1是NlpC/P60超家族成員，有一個進化上保守的催化中心和結構核。Tse1序列上并無可調(diào)節(jié)自身活性的序列，提示其更

11、具破壞性和殺傷力。
　　 2)不同于已解析三維結構的NlpC/P60家族的其他成員，Tse1空間結構中有四個反平行β-折疊片，而一般的NlpC/P60則擁有5個。代替第五個反平行β-折疊片，是一個可與Tsi1相互作用的功能性loop，進化上使其與Tsi1的抑制功能相適應。
　　 3) Tse1單體全結構是個包括花瓣和花萼的花樣（flower-like）結構，其中兩個裂溝形成一個Y型的活性位點凹槽，區(qū)別于NlpC/P60家

12、族經(jīng)典的Ⅴ型活性位點凹槽。催化中心的第三個氨基酸是半胱氨酸殘基，并且在功能上是非必需的，這也區(qū)別于已解析三維結構的NlpC/P60家族的其他成員。也就是說，Tse1反應中心是個催化二聯(lián)體，而不是NlpC/P60家族經(jīng)典的催化三聯(lián)體。
　　 4)在保守的Gly67后插入了一個helix，表明Tse1雖然在進化上屬于NlpC/P60超家族，但是其通過突變和插入獲得了新的特性。
　　 5) Tsi1在序列上，與半胱氨酸蛋白酶抑

13、制劑家族的木瓜蛋白酶抑制劑幾乎無同源性。
　　 6) Tsi1采用全β-片折疊，形成一個半β-螺旋槳樣(β-propeller-like)結構。Tsi1結構中，連接β-片的功能性loop類似于5個指頭，可與Tse1相互作用，其中位于HI loop的Ser109可直接與Tse1反應中心氨基酸殘基相互作用。Tsi1采用的是更特異和更緊密的五指接觸模式來抑制Tse1，區(qū)別于已發(fā)現(xiàn)的經(jīng)典的半胱氨酸蛋白酶抑制劑與酰胺酶的三部分（三指）相互

14、作用模式。
　　 7)通過Tsi1-Tse1與cystatin-peptidase(如stefin A-cathepsin H)結構比對，表明Tsi1采用更多的分子間H鍵，更多的功能性loop和更大的接觸表面來抑制Tsel的酰胺酶活性。提示我們，Tsi1-Tse1間這種區(qū)別于一般的半胱氨酸蛋白酶抑制劑-酰胺酶的高特異性和高緊密的相互作用模式的趨同進化(converged evolution)，可能是銅綠假單胞菌細胞代謝循環(huán)中細胞