鰻弧菌MHK3株T6SS的功能性表達(dá)及抗菌特性.pdf

1、鰻弧菌（Vibrio anguillarum）是重要的海水養(yǎng)殖動(dòng)物病原菌，廣泛生存于各種不同的海洋環(huán)境中。海洋細(xì)菌具有多種適應(yīng)海洋環(huán)境的策略，而鰻弧菌適應(yīng)海洋生態(tài)環(huán)境的機(jī)制研究不多。細(xì)菌的Ⅵ型分泌系統(tǒng)(T6SS)是一種新的蛋白分泌系統(tǒng)，在許多海洋細(xì)菌的致病性和環(huán)境適應(yīng)性方面發(fā)揮重要作用。本文開展了鰻弧菌MHK3株T6SS的表達(dá)及其介導(dǎo)的抑菌作用的研究，旨在深入了解鰻弧菌的生態(tài)適應(yīng)機(jī)制。主要的研究?jī)?nèi)容和結(jié)果如下:
　　1.不同培養(yǎng)條

2、件對(duì)鰻弧菌MHK3 T6SS表達(dá)和分泌功能的影響。Hcp（溶血素共調(diào)蛋白）是依賴T6SS分泌的一個(gè)基質(zhì)蛋白，有T6SS的細(xì)菌能夠?qū)cp分泌到細(xì)菌外是T6SS具有功能的一個(gè)重要特征。在實(shí)驗(yàn)室適宜培養(yǎng)條件下，鰻弧菌MHK3的T6SS具有分泌Hcp的功能。本研究利用qRT-PCR和Western bolt方法，分析MHK3在各種溫度(10℃、16℃、28℃、37℃)、鹽度(0.2％、0.5％、1.0％、3.0％、5.0％NaCl)和pH(6

3、、7、8、9、10)條件下表達(dá)和分泌Hcp的特征。結(jié)果顯示，Hcp在10-37℃培養(yǎng)時(shí)均可表達(dá)和分泌，在轉(zhuǎn)錄水平上，Hcp mRNA表達(dá)量隨溫度升高而降低，在10℃的表達(dá)量最高;在蛋白水平上，胞內(nèi)Hcp蛋白量在10-37℃變化不大，而胞外Hcp蛋白量在10-28℃較高，在37℃較低。Hcp在0.2-5％NaCl均有表達(dá)和分泌，在轉(zhuǎn)錄水平上，Hcp mRNA表達(dá)量在3％NaCl條件下最高，在其它鹽度條件下的表達(dá)量均較低;在蛋白水平上，胞內(nèi)

4、和胞外Hcp蛋白量在0.5-5％NaCl均較高，在0.2％NaCl條件下較低。Hcp在pH6-10均有表達(dá)，在轉(zhuǎn)錄水平上，Hcp mRNA表達(dá)量在pH8時(shí)最高;在蛋白水平上，胞內(nèi)和胞外的Hcp蛋白量隨pH提高而減少，在pH10時(shí)MHK3不分泌Hcp。蛋白穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，分泌到胞外的Hcp蛋白8h內(nèi)保持穩(wěn)定而不降解。上述結(jié)果表明，在海洋環(huán)境的物理因子變化較劇烈的條件下，鰻弧菌依然能夠表達(dá)和分泌Hcp，發(fā)揮T6SS的分泌功能。
　

5、　2.密度感應(yīng)系統(tǒng)調(diào)節(jié)基因luxO對(duì)MHK3 T6SS表達(dá)和分泌的影響。構(gòu)建了MHK3 luxO基因的缺失突變株（ΔluxO），研究發(fā)現(xiàn)在實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)條件下ΔluxO的生長(zhǎng)速率變慢。通過qRT-PCR和Western blot比較分析MHK3野生株及突變株ΔluxO、ΔvasC（MHK3 T6SS結(jié)構(gòu)基因vasC的缺失株）在不同生長(zhǎng)時(shí)期（OD540nm=0.1、0.6、1.0、2.0）Hcp的表達(dá)和分泌。結(jié)果顯示，與野生株MHK3相比，在

6、整個(gè)生長(zhǎng)期ΔluxO和ΔvasC的Hcp mRNA轉(zhuǎn)錄水平很低，ΔluxO的胞內(nèi)和胞外沒有檢測(cè)到Hcp蛋白，而僅在ΔvasC胞內(nèi)能檢測(cè)到Hcp蛋白。這些結(jié)果說明，luxO基因在轉(zhuǎn)錄水平上影響hcp基因的表達(dá);vasC基因的缺失導(dǎo)致T6SS結(jié)構(gòu)不完整，影響Hcp分泌到細(xì)胞外。
　　3.鰻弧菌MHK3 T6SS介導(dǎo)的抑菌作用。分別建立野生株MHK3（T6SS具有分泌Hcp的功能，Hcp+）及其突變株ΔluxO(T6SS沒有分泌Hcp的

7、功能，Hcp)、ΔvasC(Hcp)與大腸桿菌(Escherichia coli)和遲緩愛德華氏菌(Edwardsiella tarda)的共培養(yǎng)體系，相互作用4h后進(jìn)行細(xì)菌計(jì)數(shù)。結(jié)果顯示，在MHK3(Hcp+)與E.coli(Hcp-)或E.tarda(Hcp-)的共培養(yǎng)體系，MHK3(Hcp+)的數(shù)量沒有明顯變化，而E.coli(Hcp-)或E.tarda(Hcp-)的細(xì)菌數(shù)量下降2-3 logs;在ΔluxO(Hcp-)或Δvas