磷氮霉素生物合成基因簇的克隆及功能研究.pdf

1、磷氮霉素（PNs，也稱Phoslactomycins，PLMs）是由多種鏈霉菌產(chǎn)生的具有抗真菌、抗腫瘤活性的一類多組分聚酮類化合物，因分子中含有磷酸基和氨基而得名。它們是蛋白磷酸化酶2A（PP2A）的選擇性抑制劑，有發(fā)展成為抗腫瘤藥物先導(dǎo)或農(nóng)用抗真菌生物農(nóng)藥的潛力。然而PNs的哺乳動(dòng)物毒性限制了其作為農(nóng)藥的應(yīng)用前景。基于此，本課題主要目標(biāo)是克隆PNs生物合成基因簇，通過(guò)對(duì)PNs生物合成機(jī)制研究，闡明其獨(dú)特酶催化反應(yīng)機(jī)制，利用代謝工程和生

2、物化學(xué)方法改造其化合物結(jié)構(gòu)，獲取PNs的“非天然”的天然產(chǎn)物類似物。希望發(fā)現(xiàn)生物活性保持或提高而毒性降低的PNs類似物，為新型生物農(nóng)藥的發(fā)現(xiàn)與開(kāi)發(fā)奠定基礎(chǔ)。 依據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道并優(yōu)化發(fā)酵條件，使PNs的發(fā)酵產(chǎn)量穩(wěn)定在較高水平；在E.coli ET12567和Streptomyces platensis SAM—0654之間建立了有效的接合轉(zhuǎn)移遺傳轉(zhuǎn)移系統(tǒng)；同時(shí)采用pCClFos為載體構(gòu)建了高質(zhì)量基因組文庫(kù)，效價(jià)達(dá)8000cfu/μgD

3、NA。 根據(jù)已經(jīng)報(bào)道的來(lái)源于Streptomyces HK803的PLMs生物合成基因簇同源基因設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物：以S.platensis SAM—0654基因組DNA為模板，通過(guò)PCR擴(kuò)增克隆得到一高同源性基因片段；以此基因片段標(biāo)記探針對(duì)S.platensisSAM—0654基因組文庫(kù)進(jìn)行原位雜交篩選，并結(jié)合染色體步移技術(shù)得到了與PNs合成相關(guān)的完整生物合成基因簇。 通過(guò)測(cè)序共獲得約100kb連續(xù)DNA序列，共包含40個(gè)開(kāi)

4、放閱讀框架；推測(cè)其中的22個(gè)ORF與PNs的生物合成相關(guān)。這22個(gè)ORF包含了7個(gè)PKS基因，2個(gè)負(fù)責(zé)乙基丙二酰輔酶A合成基因，4負(fù)責(zé)環(huán)己酰輔酶A合成個(gè)基因，一個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因，6個(gè)后修飾基因，兩個(gè)調(diào)控基因。在生物信息學(xué)分析基礎(chǔ)上提出了PNs生物合成途徑，并通過(guò)基因中斷證實(shí)了該基因簇與PNs的生物合成相關(guān)性。 對(duì)比克隆到得S.platensisSAM—0654的PNs生物合成基因簇與文獻(xiàn)報(bào)道的S.HK803中PLMs生物合成基因簇

5、發(fā)現(xiàn)宿主菌產(chǎn)生產(chǎn)生同一化合物的生物合成基因具有較高同源性，但二者的前體生物合成基因和調(diào)控基因存在較大差異。借助于PCR—targrting方法致力于兩個(gè)前體基因pnP5，pnP6及兩個(gè)調(diào)控基因pnR1，pnR2的功能研究。 總之，PNs生物合成基因簇的克隆與功能研究及與PLMs生物合成基因簇對(duì)比提示同一化合物在不同宿主菌種可能有完全不同的調(diào)控機(jī)制，其進(jìn)一步深入研究將推動(dòng)PNs作為生物農(nóng)藥的開(kāi)發(fā)和發(fā)展。 上述工作為開(kāi)發(fā)磷氮