聚酮合酶基因簇cluster9和Aureothin生物合成基因簇中調(diào)控因子AurD的研究.pdf

1、聚酮化合物種類繁多，通常具有抗細菌、抗真菌、抗腫瘤、免疫抑制等多種生物活性，因而引起人們的廣泛關注。聚酮化合物的碳鏈骨架由聚酮合酶催化。不同類型聚酮化合物生物合成途徑的揭示，將為未來發(fā)現(xiàn)乃至創(chuàng)造新型聚酮化合物的研究指明方向。本研究以兩個聚酮合酶基因簇為研究對象，利用遺傳學、分子生物學、生物化學的研究方法，對基因簇的功能及調(diào)控進行了探索。
　　1鏈霉菌SH-62基因組中聚酮合酶基因簇cluster9的研究
　　來自鏈霉菌SH-

2、62的聚酮合酶基因簇cluster9屬于Ⅰ型PKS，與數(shù)據(jù)庫中已知的天然產(chǎn)物合成基因簇同源性較低，可能是一個新的天然產(chǎn)物生物合成基因簇。包含有聚酮合酶基因簇cluster9的BAC質(zhì)粒在Streptomyces albus中異源表達產(chǎn)生3個疑似的代謝產(chǎn)物。為了檢測這3個化合物與cluster9的相關性，采用兩種基因組編輯方法，包括λ-Red介導的PCR-targeting系統(tǒng)和CRISPR/Cas9-CodA(sm)系統(tǒng)，對cluste

3、r9中的核心pks基因進行了敲除。發(fā)現(xiàn)核心基因的敲除沒有影響3個化合物的合成，說明它們并不是cluster9的異源表達產(chǎn)物。
　　2Aureothin生物合成基因簇中調(diào)控因子AurD的研究
　　Aureothin是具有良好生物活性的硝基芳香類抗生素，在其生物合成基因簇中只發(fā)現(xiàn)了一個潛在的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子aurD。敲除aurD基因會阻斷aureothin的合成過程，而aurD基因的回補實驗一直無法成功?？紤]到aurD基因的過量表達

4、可能會影響細胞的生長，因此本研究采用了基因原位回補的方法，將安裝有組成型強啟動子PermE*的aurD基因重新插入到原基因的敲除位點，成功獲得了基因回補突變菌株?；匮a菌株的發(fā)酵產(chǎn)物分析證實aurD基因的回補能夠恢復aureothin的產(chǎn)生，并且因為組成型強啟動子增強了aurD基因的表達使得aureothin產(chǎn)量顯著提升，進一步地證實了aurD對aureothin生物合成的正調(diào)控效應。
　　AurD具有一個OmpR類DNA結合結構域