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文檔簡介
1、聚酮合酶(polyketide synthase)是催化產(chǎn)生多種類型的聚酮化合物及其復(fù)雜的衍生物的關(guān)鍵酶,其中部分化合物具有重要的藥理學(xué)活性。分離、鑒定與異源表達(dá)這些合成生物活性化合物的新PKS,成為生物技術(shù)藥物研究領(lǐng)域的重點。
本研究提取了中國東海的一株解淀粉芽孢桿菌F201721的基因組DNA,構(gòu)建了它的細(xì)菌人工染色體文庫(BAC文庫),通過設(shè)計簡并引物,拼接擴(kuò)增出PKS基因簇的編碼序列共計531835bp。通過數(shù)據(jù)庫
2、和生物信息學(xué)軟件對基因組進(jìn)行了解析:它是一個基因簇,編碼9個模塊,負(fù)責(zé)編碼41個與聚酮合成相關(guān)的酶。與陸地來源的解淀粉芽孢桿菌FZB42中PKS相比,海洋來源的PKS在啟動子位置附近缺少了25個堿基。通過軟件預(yù)測推測,這25個堿基可能調(diào)控PKS的表達(dá)。通過EMSA分析,發(fā)現(xiàn)有特異性的蛋白與這25個堿基結(jié)合,蛋白分子量約為35KD。結(jié)合抑菌實驗發(fā)現(xiàn),這個與啟動子特異性結(jié)合的蛋白表達(dá)發(fā)生在細(xì)菌對數(shù)生長期,也就是說,這個蛋白對于PKS的表達(dá)是
3、有抑制作用的。
在這兩株菌中,蛋白在對數(shù)生長期與含有25個堿基的啟動子序列是有結(jié)合的,抑菌圈直徑是2cm:在對數(shù)生長期后期,F(xiàn)ZB42中有蛋白和含有缺失堿基的啟動子序列結(jié)合,但是在F201721中未發(fā)現(xiàn)蛋白可以與之結(jié)合,結(jié)合抑菌圈實驗,在細(xì)菌生長穩(wěn)定期后期,F(xiàn)ZB42中的抑菌圈明顯比F201721的大,表明這個蛋白可以抑制PKS的表達(dá),在對數(shù)期后期,特異性蛋白從啟動子序列上A脫落,啟動了PKS的表達(dá),使得FZB42中mac
4、rolactins的產(chǎn)量大于F201721的macrolactins的產(chǎn)量,表現(xiàn)為FZB42中抑菌圈大于F201721中的抑菌圈。驗證了缺失的25個堿基在macrolactins表達(dá)方面起調(diào)控作用,也說明了這兩株菌中,PKS的表達(dá)機制是有差異的。
一、構(gòu)建F201721的細(xì)菌人工染色體文庫
這株來自中國東海的芽孢桿菌F201721是本室保存的。通過低熔點瓊脂糖法抽取細(xì)菌基因組DNA,獲得的基因組DNA分子量在
5、200kb,再用BamHⅠ酶切10min,獲得平均長度為100kb的片段,電洗脫去鹽去離子以后,使用Epicentre試劑盒構(gòu)建BAC文庫,通過藍(lán)白斑篩選獲得含有合適片段大小的陽性克隆,通過BAC末端測序,期望獲得含有PKS編碼序列的陽性克隆,經(jīng)blastn分析發(fā)現(xiàn),篩選得到的陽性克隆都不含完整的macrolactins編碼序列,不能直接用于異源表達(dá)。
二、獲得的PKS編碼序列并對其進(jìn)行序列和功能分析
根據(jù)已
6、經(jīng)全基因組測序的FZB42上PKS編碼序列中,通過NCBI的Conserved Domains Database找出保守區(qū)域并適合設(shè)計引物14對,每對引物上下游間隔為6kb-10kb,退火溫度在65℃-73℃之間,上下游引物的退火溫度相差不超過5℃,引物長度為25bp,通過使用TaKaRa公司的Lataq酶進(jìn)行長鏈PCR擴(kuò)增,PCR模板為含有PKS編碼序列的陽性克隆中的BAC重組子,PCR產(chǎn)物做膠回收以后送Invitrogen(英駿)進(jìn)
7、行序列測定,通過片段拼接得到了macrolactins生物合成基因簇的編碼序列,全長531835bp,經(jīng)NCBI數(shù)據(jù)庫序列以及功能分析,我們得到了F201721的PKS基因簇編碼序列,共有9個模塊,含有負(fù)責(zé)聚酮合成的41個酶,發(fā)現(xiàn)這些序列與FZB42中的核苷酸序列高度同源,最低的相似度是97%,最高的達(dá)到100%。氨基酸相似度最高為99%,氨基酸最低為96%。在分析序列時,我們注意到,與陸地來源的解淀粉芽孢桿菌相比,海洋來源的解淀粉芽孢
8、桿菌F201721中PKS編碼序列前面的啟動子區(qū)域缺少了25個堿基,通過網(wǎng)上不同類型的promoter predict軟件分析發(fā)現(xiàn),缺失的25個堿基在PKS編碼序列上游啟動子位置,指示在PKS表達(dá)調(diào)控上起作用。
三、驗證兩株菌中聚酮合酶基因簇由于序列差異引起的表達(dá)調(diào)控差異
使用不同的類型的promoter predict軟件分析,預(yù)測顯示缺失片段位于啟動子區(qū)域。由于在枯草芽孢桿菌中,次級代謝產(chǎn)物的調(diào)控通常是通
9、過轉(zhuǎn)換不同的σ因子來調(diào)控的,我們預(yù)測該缺失片段可能通過結(jié)合特定蛋白調(diào)控macrolactins表達(dá)。通過蛋白遷移率實驗,發(fā)現(xiàn)有蛋白在細(xì)菌對數(shù)生長期到穩(wěn)定期前可以與這段DNA結(jié)合。隨著細(xì)菌生長進(jìn)入平臺期,F(xiàn)ZB42中特異結(jié)合該序列的蛋白消失了,而細(xì)菌的抑菌圈明顯增大,說明與缺失片段結(jié)合的蛋白調(diào)控了Macrolactins的表達(dá),使得Macrolactins的產(chǎn)量在穩(wěn)定期后期明顯增加。也側(cè)面驗證了編碼序列確實可以合成大環(huán)內(nèi)酯類24元環(huán)的聚酮
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