林可霉素生物合成抗性基因的功能研究.pdf

1、林可霉素(Lincomycin)及其衍生物是一類在臨床上廣泛應(yīng)用的林可酰胺類抗生素，主要用于治療革蘭氏陽性菌引起的感染。由于林可霉素具有很重要的藥用價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值，提高林可霉素產(chǎn)量始終是科研人員和企業(yè)家關(guān)注的焦點(diǎn)。近年來已從兩個(gè)方面研究取得重要進(jìn)展，一是通過發(fā)酵工程優(yōu)化其生產(chǎn)工藝;二是通過基因工程途徑改良菌種。前者提高產(chǎn)量有限，而且也漸入瓶頸，后者具有更大的提升產(chǎn)量潛力，是人們一直關(guān)注的焦點(diǎn)。林可霉素生物合成基因簇中存在三個(gè)抗性基因lm

2、rA、lmrB和lmrC，其中l(wèi)mrA和lmrC是可能的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因。通過生物信息學(xué)分析，LmrA是具有14次跨膜結(jié)構(gòu)的MFS超家族的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，與抗生素運(yùn)輸有關(guān);LmrC屬于ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族，但其不含跨膜的結(jié)構(gòu)，只編碼ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的ATP結(jié)合結(jié)構(gòu)域;而LmrB與AdoMetMTases超家族成員有著很高的同源性，該家族的酶主要是在23SrRNA的2058位腺嘌呤的N6位進(jìn)行單或雙甲基化作用，推斷LmrB可能是通過修飾23SRNA使其

3、與林可霉素結(jié)合能力減弱而產(chǎn)生抗性。因此，林可鏈霉菌很可能存在著rRNA的甲基化修飾降低產(chǎn)物親和力與產(chǎn)物外排這兩種林可霉素抗性機(jī)制，但迄今并沒有進(jìn)行深入的功能研究。本課題以林可鏈霉菌中林可霉素生物合成抗性基因的功能研究為切入點(diǎn)，為最終構(gòu)建林可霉素高抗高產(chǎn)的衍生菌株奠定了基礎(chǔ)。
　　 首先，通過同源重組在林可霉素高產(chǎn)菌株林可鏈霉菌LC-G中構(gòu)建了lmrA缺失突變株XJJ4。在工業(yè)培養(yǎng)基中發(fā)酵時(shí)，相比出發(fā)菌株LC-G，XJJ4的林可霉

4、素產(chǎn)量下降了75％?？剐詸z測顯示XJJ4耐受林可霉素的最高濃度降低了約九倍。通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析發(fā)現(xiàn)，突變株XJJ4中林可霉素生物合成基因lmbA、lmbR和調(diào)控基因lmbU的轉(zhuǎn)錄均明顯低于LC-G。另外我們構(gòu)建了lmrA回補(bǔ)菌株XJJ5，其林可霉素產(chǎn)量回補(bǔ)到了LC-G的42％。進(jìn)一步在LC-G中構(gòu)建了lmrA過表達(dá)菌株XJJ6，并進(jìn)行了林可霉素產(chǎn)量、抗性及其生物合成基因的轉(zhuǎn)錄分析，相比LC-G中轉(zhuǎn)入空載的菌株XJJ2，XJJ6的

5、產(chǎn)量提高了29％，耐受林可霉素的最高濃度提高了約八倍，并且在XJJ6中，lmrA的轉(zhuǎn)錄提高了20～30倍的同時(shí)，林可霉素生物合成基因lmbA、lmbR和調(diào)控基因lmbU的轉(zhuǎn)錄均明顯升高。這些結(jié)果顯示LmrA是一個(gè)負(fù)責(zé)林可霉素運(yùn)輸?shù)霓D(zhuǎn)運(yùn)蛋白，可通過影響林可霉素生物合成的結(jié)構(gòu)基因和調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄而實(shí)現(xiàn)的，因此LmrA不僅具有通過外排林可霉素產(chǎn)生抗性的能力，還能通過增加林可霉素的外排進(jìn)一步提高產(chǎn)量。
　　 其次，通過同源重組在林可霉素

6、高產(chǎn)菌株林可鏈霉菌LC-G中構(gòu)建了lmrC缺失突變株XJJ7。高效液相色譜分析和抗性檢測顯示，相比出發(fā)菌株LC-G，XJJ7的林可霉素產(chǎn)量下降了55％，而且耐受林可霉素的最高濃度降低了約一倍。通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析發(fā)現(xiàn)，突變株XJJ7中林可霉素生物合成基因lmbA和lmbR的轉(zhuǎn)錄均明顯低于LC-G，但調(diào)控基因lmbU沒有變化。構(gòu)建的lmrC回補(bǔ)菌株XJJ8的林可霉素產(chǎn)量回補(bǔ)到了LC-G的55％。進(jìn)一步在LC-G中構(gòu)建了lmrC過表達(dá)

7、菌株XJJ9，并進(jìn)行了林可霉素產(chǎn)量、抗性及其生物合成基因的轉(zhuǎn)錄分析，相比LC-G中轉(zhuǎn)入了空載的菌株XJJ2，XJJ9的產(chǎn)量沒有提高，但耐受林可霉素的最高濃度提高了約兩倍，并且林可霉素生物合成基因lmbA、ImbR和調(diào)控基因lmbU的轉(zhuǎn)錄均沒有明顯變化。這些結(jié)果暗示ImrC編碼的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白ATP結(jié)合亞基，作為抗生素非特異性的外運(yùn)蛋白，很可能林可鏈霉菌基因組中編碼的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白跨膜亞基形成二聚體，行使其轉(zhuǎn)運(yùn)活性。因此，在體外高濃度的林

8、可霉素環(huán)境下，LmrC可充分發(fā)揮其轉(zhuǎn)運(yùn)能力并外排進(jìn)入胞內(nèi)的林可霉素;而當(dāng)菌體內(nèi)林可霉素的濃度較低時(shí)，即使lmrC的過表達(dá)也難以進(jìn)一步提高林可霉素產(chǎn)量。
　　 此前，我們通過林可霉素野生型與高產(chǎn)工業(yè)菌株的比較基因組分析，發(fā)現(xiàn)LC-G中的lmrB缺失了156個(gè)堿基，很可能影響了產(chǎn)生菌的抗性與產(chǎn)量。通過Redirect技術(shù)在野生菌中缺失了lmrB基因。同時(shí)，我們將來源于野生菌中的lmrB基因在LC-G進(jìn)行表達(dá)，以考察能否進(jìn)一步提高產(chǎn)量