芳香聚酮抗生素美達霉素生物合成基因的功能研究.pdf

1、聚酮抗生素美達霉素（medermycin）具有抗菌和抗腫瘤等生物學活性，其生物合成途徑還未闡明。本文利用生物信息學、遺傳學和分析化學等手段，就其生物合成基因簇中幾個相關基因展開功能分析，內容包括以下幾個方面： （1）新型C-糖基轉移酶基因：根據同源性分析，推斷基因med-ORF8可能負責催化美達霉素的C-C糖苷健的形成（Ichinose K.et al.，2003）。本研究首先使用目前較為常用的PCR介導的鏈霉菌基因突變系統(tǒng)（R

2、edirectTM）對med-ORF8進行基因突變分析：完整的美達霉素生物合成基因簇導入一個特殊大腸桿菌細胞，在這個細胞內，定點敲除美達霉素生物合成基因簇中的這個目的基因med-ORF8，獲得-個攜帶有美達霉素突變基因簇的質粒（命名為pHSL3），將其導入一個常用鏈霉菌異源表達細胞（Streptomyces coelicolorCH999）中，并進行發(fā)酵產物的提取和LC-MS分析。研究發(fā)現同野生完整的美達霉素基因簇相比，突變基因簇不能合

3、成美達霉素（初步推斷有脫糖基中間產物積累）；然后進行目的基因的互補分析，即構建了一個關于med-ORF8的鏈霉菌表達質粒pHSL5，導入上面所獲得的突變基因簇表達體系中。對基因回補菌株的發(fā)酵產物進行分析，發(fā)現med-ORF8的導入導致美達霉素又重新產生，說明在美達霉素生物合成途徑中，基因med-ORF8確實是個必需基因。 （2）糖基合成酶基因：在美達霉素生物合成基因簇中含有6個脫氧六碳糖基合成酶的同源基因，推測負責稀有的脫氧六碳

4、糖胺（安哥拉糖胺）的形成，前期工作中這6個可能參與糖基合成的基因和上面研究的med-ORF8已經克隆在一個表達質粒上（pAYT55）。本研究利用這個多基因共表達體系來驗證這些基因的功能，即將這個多基因共表達質粒通過原生質體轉化導入一個能產生芳香聚酮kalafungin（推測與med-ORF8的糖基受體結構相似）的鏈霉菌細胞（Streptomyces coelicolor B135）中，然后對這個體系的代謝產物進行LC/MS分析。結果顯示

5、以上這7個基因的共表達質粒在B135中可以導致美達霉素的積累，而僅含這6個糖基合成酶基因的共表達質粒導入B135中，則沒有檢測到美達霉素的產生。此結果說明在美達霉素生物合成途徑中，這6個基因與med-ORF8共同完成了糖基合成和糖基轉移的功能。 （3）新型轉錄調控基因：根據同源性分析推斷在美達霉素生物合成基因簇中的med-ORF10為一個新型轉錄調控基因（Taguchi T.et al.，2007）。前期工作中利用Redirec

6、TM系統(tǒng)已經構建好一個突變基因簇（即在完整美達霉素生物合成基因簇中定向敲除目的基因med-ORF10）。本研究將攜帶這個突變基因簇的質粒pAYT64通過原生質體轉化導入鏈霉菌的異源表達宿主（Streptomyces coelicolor CH999）中。對獲得的菌株的發(fā)酵產物進行LC-MS分析。結果顯示由于這個基因的敲除導致美達霉素產量急劇減少，同時有中間體積累，說明該基因在美達霉素生物合成中起到正向調控作用。 以上這些研究結果