核苷類抗生素Muraymycin生物合成機(jī)理的研究.pdf

1、muraymycin是從鏈霉菌Streptomyces sp.NRRL30471的發(fā)酵產(chǎn)物中分離到的一類新型核苷-脂肽類抗生素。該抗生素結(jié)構(gòu)比較獨(dú)特,含有一個異卷須霉啶(epicapreomycidine)和一個脲鍵,而且該抗生素的所有組分都含有一個連接短肽的糖基化的糖醛酸。Muraymycin與近年來研究得比較多的核苷類抗生素如殺綠霉素(pacidamycin)和卡普拉霉素(caprazamycin)結(jié)構(gòu)類似。
　　 mura

2、ymycin通過抑制細(xì)菌細(xì)胞壁的合成來達(dá)到抑菌效果,它的作用靶標(biāo)是細(xì)菌肽聚糖合成的轉(zhuǎn)位酶Ⅰ(MraY),此酶催化ρ-N-乙酰胞壁酸五肽形成lipidⅠ——肽聚糖合成途徑中的一種重要的中間體。近來,由于肽核苷類抗生素結(jié)構(gòu)獨(dú)特以及作用于新的靶標(biāo),所以引起廣泛的關(guān)注。到現(xiàn)在為止,尼可霉素(nikkomycin)、多氧霉素(polyoxin)、卡普拉霉素(caprazamycin)、脂硫霉素(liposidomycin)、A500359和殺綠霉

3、素(pacidamycin)等抗生素的生物合成基因簇都已經(jīng)被克隆。
　　 自2002年被發(fā)現(xiàn)以來,關(guān)于muraymycin的研究集中在化學(xué)合成它的組分及其類似物以期獲得更好的活性以及選擇性,而對此抗生素的生物合成機(jī)制一無所知。
　　 本課題組構(gòu)建了Streptomyces sp.NRRL30471的基因組文庫,并利用muraymycin類似的抗生素卡普拉霉素(caprazamycin)生物合成的基因cpz14,設(shè)計(jì)簡并引

4、物從此文庫中篩選出14個陽性克隆。將其中18F3測序,結(jié)果顯示,此43-4-kb的連續(xù)片段包含33個ORF,推測其中的26個可能涉及muraymycin的生物合成。利用遺傳學(xué)方法分別中斷mur16和mur17基因都導(dǎo)致muraymycin生物合成的終止,說明這兩個基因都是此抗生素生物合成的必需基因。另外,中斷mur32基因?qū)е耺uraymycin的產(chǎn)量急劇下降,而中斷mur34基因?qū)е庐a(chǎn)量急劇上升,說明前者是此基因簇中的正調(diào)控基因,而后

5、者是負(fù)調(diào)控基因。利用pET系統(tǒng)表達(dá)Mur34蛋白并通過鎳柱純化,將之與muraymycin生物合成基因簇中的5個啟動子區(qū)DNA片段進(jìn)行結(jié)合實(shí)驗(yàn),結(jié)果顯示,Mur34蛋白可以結(jié)合mur33/32及mur36/35的啟動子區(qū)DNA,暗示該蛋白可能通過結(jié)合下游的mur33/32及mur36/35的啟動子DNA區(qū)來調(diào)控這四個基因的轉(zhuǎn)錄。另外,通過將改造過的18F3 cosmid整合到S.lividans TK24的基因組中并發(fā)酵,成功異源表達(dá)出