吸水鏈霉菌10-22中硫肽類抗生素cyclothiazomycin生物合成機(jī)制的研究.pdf

1、硫肽類抗生素是一類由微生物生產(chǎn)的重要天然產(chǎn)物，對(duì)很多高抗藥病原菌都有很強(qiáng)的抑制作用。它們共享一些典型的結(jié)構(gòu)特征，包括含多個(gè)半胱氨酸衍生的兩個(gè)氨基酸殘基間的異源環(huán)（包括噻唑和噻唑啉）、分子結(jié)構(gòu)中心位置的6元含氮雜環(huán)（吡啶或者脫水哌啶環(huán)）。多年來(lái)，這些不同尋常的氨基酸衍生結(jié)構(gòu)一直吸引著有機(jī)化學(xué)家們?cè)趯?shí)驗(yàn)室中嘗試通過(guò)有機(jī)合成的手段來(lái)實(shí)現(xiàn)，但是生物體本身究竟是如何合成這類產(chǎn)物，卻很少有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)來(lái)描述其生物合成過(guò)程。
　　 環(huán)噻唑霉素(

2、cyclothiazomycin，CLT)是一種新近分離且已經(jīng)有立體化學(xué)結(jié)構(gòu)鑒定報(bào)道的硫肽類抗生素，有腎素抑制劑的應(yīng)用潛力。它是一種比較特別的硫肽類抗生素，除了具備硫肽類的共有特征外，自身有多處結(jié)構(gòu)較為罕見，包括非2，3-位噻唑取代的中心吡啶環(huán)，噻唑啉和噻唑的數(shù)目平分秋色以及一個(gè)叔碳上的硫醚鍵。
　　 本實(shí)驗(yàn)室保存的吸水鏈霉菌應(yīng)城變種10-22由我國(guó)科學(xué)家分離得到，能夠產(chǎn)生三種農(nóng)用抗生素的，其中一種多肽類抗生素5102-11的生

3、物合成機(jī)制多年來(lái)困擾著我們。NRPS思路的失敗令我們轉(zhuǎn)而考慮核糖體合成的途徑?；诖瞬孪?，利用一對(duì)基于核糖體合成途徑中特有的環(huán)化脫水酶的保守序列設(shè)計(jì)的兼并引物，我們從10-22的基因組中克隆到了一個(gè)0.7kb的目標(biāo)片段?；谠撈卧O(shè)計(jì)的特異引物在10-22基因組文庫(kù)中釣到了兩個(gè)陽(yáng)性柯絲質(zhì)粒(cosmid)。限制性內(nèi)切酶消化后的片段序列測(cè)序結(jié)果證實(shí)，其中包含有一小段DNA序列，編碼60aa的一個(gè)多肽，其中C端18aa的序列和CLT的結(jié)構(gòu)氨

4、基酸序列順序完全一致。后續(xù)的生測(cè)實(shí)驗(yàn)、QTOF分子量檢測(cè)分析以及二級(jí)質(zhì)譜碎片分析都證明10-22所產(chǎn)的多肽類抗生素就是CLT。
　　 柯絲質(zhì)粒測(cè)序結(jié)果顯示整個(gè)35kb左右的插入片段中包含了27個(gè)ORF。根據(jù)ORF的分布情況，我們構(gòu)建了多個(gè)異源表達(dá)載體，首次在鏈霉菌的模式菌株變鉛青鏈霉菌Streptomyces lividans1326中實(shí)現(xiàn)硫肽類抗生素的異源表達(dá)，并通過(guò)不同ORF的組合定位出了一個(gè)完整的環(huán)噻唑霉素合成基因簇。這是

5、一個(gè)包含了15個(gè)ORFs、長(zhǎng)度為22.7kb的核苷酸序列，生物信息學(xué)分析表明其中唯一一個(gè)結(jié)構(gòu)基因cltA編碼產(chǎn)生環(huán)噻唑霉素前體，前體多肽再經(jīng)由基因簇中的其他蛋白進(jìn)行翻譯后修飾，最終成熟并釋放至胞外。
　　 我們推測(cè)整個(gè)過(guò)程中有9個(gè)蛋白參與，其中6個(gè)基因，cltBCDEFG，圍繞在前體肽基因cltA周圍可能成一個(gè)大的操縱子，他們負(fù)責(zé)環(huán)噻唑霉素主體結(jié)構(gòu)的合成，包括：CltB負(fù)責(zé)對(duì)半胱氨酸(Cys)殘基和其臨近的殘基之間脫水環(huán)化形成分

6、子間的異源噻唑啉；CltC則選擇性識(shí)別成雙的噻唑啉結(jié)構(gòu)而只催化脫氫N端的一個(gè)從而形成CLT分子中噻唑啉和噻唑啉平分秋色的局面；2，3位非噻唑環(huán)取代的中心吡啶區(qū)域的形成則可能包括環(huán)化脫水、前導(dǎo)鏈切除和脫氨基三個(gè)過(guò)程，CltD由于擁有環(huán)化脫水酶和肽酶兩個(gè)結(jié)構(gòu)域，被認(rèn)為是負(fù)責(zé)催化吡啶形成的主力軍，并由此推測(cè)吡啶形成和前導(dǎo)肽的切除是同時(shí)進(jìn)行的；CltG則很可能是一個(gè)脫氨基酶；脫水氨基酸的形成和lantibiotic的情形類似，由兩個(gè)脫水酶Clt

7、E和CltF負(fù)責(zé)催化形成的。還有兩個(gè)基因cltM/N，我們認(rèn)為其編碼的產(chǎn)物負(fù)責(zé)環(huán)噻唑霉素最后成環(huán)的一個(gè)叔碳硫醚鍵的形成；該硫肽分子完成所有翻譯后修飾后，由轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白CltO識(shí)別結(jié)合成熟產(chǎn)物并將之轉(zhuǎn)運(yùn)至胞外。
　　 就在2009年初，3個(gè)不同的硫肽類抗生素的合成基因簇序列幾乎同時(shí)在三個(gè)不同的實(shí)驗(yàn)室得到突破，分析結(jié)果相當(dāng)一致，認(rèn)為硫肽類抗生素就是一類基因組編碼、核糖體合成后經(jīng)由一系列的后修飾成熟釋放的一類抑菌多肽。本研究為這個(gè)結(jié)論提供