四氫異喹啉家族抗生素Quinocarcin生物合成的初步研究.pdf

1、奎諾卡星(Quinocarcin)是1983年由日本科學(xué)家從鏈霉菌中分離到的四氫異喹啉類抗腫瘤抗生素,對革蘭氏陽性菌有著很好的活性,并且在與小鼠腫瘤細胞的反應(yīng)中體現(xiàn)出了一定的抗腫瘤活性。海鞘素743(Ecteinascidin743,ET-743)是由海鞘(Ecteinascidiaturbinete)產(chǎn)生的與Quinocarcin具有類似核心骨架的生物堿,具有很高的抗腫瘤活性(體外活性LC50<1pM,ID500.2-0.6nM,活性

2、比抗腫瘤藥物紫杉醇高約50倍),但是其海洋來源限制了研究的發(fā)展。我們以微生物來源的Quinocarcin為目標分子,從克隆生物合成基因簇出發(fā),闡明其生物合成機制,為通過代謝工程改造生產(chǎn)ET-743類似物或結(jié)合化學(xué)半合成生成ET-743及其類似物奠定基礎(chǔ)。
　　 首先通過S.12388與E coli S17-1之間的屬間接合轉(zhuǎn)移成功地建立了Quinocarcin宿主菌的遺傳轉(zhuǎn)移系統(tǒng)。同時依據(jù)末端還原酶(reductase,RE)和

3、PCP的保守基序設(shè)計簡并性引物,PCR擴增得到編碼RE的特異性基因片段。然后用所得基因片段為探針進行文庫篩選,經(jīng)過基因簇的補全成功地克隆了Quinocarcin基因組上長約40KB的DNA區(qū)域。序列測定共得到包含完整SFM-A生物合成基因簇的40KB的DNA序列,其中QncR1到QncS的24個基因與Qumocarcin的生物合成相關(guān):4個負責四肽骨架合成的基因,5個后修飾基因,5個調(diào)節(jié)基因,1個抗性基因,8個與前體相關(guān)的基因和1個未知

4、功能的基因。我們推測Quinocarcin骨架的合成是采取重復(fù)使用的NRPS機理,其中QncG的AL結(jié)構(gòu)域識別并激活長鏈脂肪酸,QncH的A結(jié)構(gòu)域識別并激活甘氨酸,QncE負責識別并激活羥化過的Tyr,QncC負責識別和激活谷氨酸。根據(jù)對基因所編碼蛋白的功能分析,我們推測了Quinocarcin的生物合成途徑?，F(xiàn)在正在通過對QncC的基因置換及互補來證明所克隆到的基因簇的正確性。
　　 總之,遺傳轉(zhuǎn)移系統(tǒng)的建立為體內(nèi)遺傳學(xué)的研究